有针对性的下一代测序和生物信息学管道评价宪政疾病的遗传决定因素

为了 ONDRI 的目的, 根据 Baycrest 老年护理中心 (多伦多、加拿大安大略省) 的研究伦理委员会获得了伦理协议和知情同意;成瘾和精神健康中心 (加拿大安大略省多伦多);伊丽莎白 Bruyère 医院 (渥太华, 安大略省, 加拿大);汉密尔顿总医院 (汉密尔顿, 安大略省, 加拿大);伦敦健康科学中心 (伦敦, 安大略省, 加拿大);麦克马斯特 (汉密尔顿, 安大略省, 加拿大);渥太华医院 (渥太华, 安大略省, 加拿大);Parkwood 医院 (伦敦, 安大略省, 加拿大);St. 迈克尔的医院 (多伦多, 安大略, 加拿大);新宁健康科学中心 (加拿大安大略省多伦多);和大学健康网络-多伦多西部医院 (多伦多, 安大略省, 加拿大)。 1. 人体血液样本中的 DNA 分离 根据适当的伦理协议和知情同意, 收集来自测序参与者的样品。 为了获得高质量的 DNA, 抽取血液样本进行提取。注: dna 也可以从唾液或颊细胞中提取, 以确保使用适当的 dna 提取试剂盒。 如果从血液中提取, 获得高产量的 DNA, 收集样品在三4毫升 EDTA K2 管, 提供一个样本的总容积 ~ 12 毫升。 离心血液样本为20分钟, 在 750 x g, 以分数进入血浆, 薄, 中间阶段的白细胞, 和红细胞的底部阶段。 用一次性转移吸管将血浆从血液样本中吹打。适当丢弃血浆或分配到多个500µL 整除数储存在-80 摄氏度, 以供将来的生化分析。确保每个样品都使用新的无菌吸管。 根据制造商的说明, 提取血液样本中的 DNA, 并抽取血液提取套件12 (材料表)。注: 如果获得上面描述的体积样本, 将获得3毫升的白细胞用于 DNA 提取。 根据制造商的说明, 使用全频谱分光光度计13 (材料表) 测量µL 中的初始 DNA 浓度。 直接执行步骤2。或者, 储存 DNA 在4摄氏度。 2. 排序库准备 在三天的过程中对 DNA 样品进行序列稀释, 以获得最终浓度为 5.0 1.0 ng/µL。 稀释1米三缓冲 pH 值8.5 到10µM 与去离子水。注: 稀释后的体积将取决于 DNA 样品的数量, 在随后的步骤中需要稀释。 如果在步骤1.4 之后直接执行 DNA 稀释, 请执行以下步骤。如果不是同一天, 测量的 DNA 浓度是在步骤1.4 中完成。 根据浓度测量, 稀释40µL 的 DNA µL 10 µM 三缓冲 pH 8.5, 并允许样本坐在4摄氏度过夜。 根据制造商的说明, 测量 dna 浓度的荧光计14适合于量化 dna ( 材料表)。注: 样品的浓度应 > 10 µL, 因为以前使用的分光光度计灵敏度较低。 根据浓度测量, 稀释20µL 的 DNA 到 10 ng/µL 使用10µM 三缓冲 pH 8.5, 并允许样本坐在4摄氏度过夜。 根据制造商的说明, 使用荧光计14测量 DNA 浓度. 根据浓度测量, 稀释10µL 的 DNA 到 5 ng/µL 使用10µM 三盐酸 pH 8.5, 并允许样本坐在4摄氏度过夜。 根据制造商的指示, 编写测序库, 并与目标产品面板的适当目标浓缩套件15 (材料表) 配合使用。确保浓缩套件适用于所使用的 “应用” 平台。 按照制造商的说明16关于库的 plexity 和汇集。注: 对于 ONDRISeq, 库由12个 DNA 样本组成, 集合在两组中, 并运行在 “.” 桌面仪器 (材料表) 中。可以在单个反应中运行的样本数将取决于所使用的排序工具包和平台。 为了获得更高质量的测序数据, 请执行可选步骤以验证 tagmentation 以下的 DNA 库质量, 在制造商的说明中描述了目标浓缩套件15。 对各图书馆进行三个方面的分析, 以保证图书馆的产出质量。 如果汇集库, 则根据制造商的说明, 用荧光计14测量 DNA 浓度.使用此浓度确定每个 DNA 库的体积, 以获得所使用的目标浓缩套件建议的摩尔比率。 3. 下一代测序 根据本机台式机仪表试剂盒制造商的说明17,18 (材料表) 对库进行序列化。 请根据制造商的说明18使用适当的产品技术软件 (材料表) 准备一个示例表单, 将其导入到 “产品” 桌面设备的工作流中。注意: 为了 ONDRISeq 的目的, 选择的应用程序选项为 “其他”, 仅有请求的 FASTQ 文件 (图 1)。随后的步骤将处理这些 FASTQ 文件, 以便完全自定义对齐和质量参数。但是, 如果选择了目标排序, 一些 VCF 工具就能够将排序数据处理到自己的文件中。可以咨询制造商的说明18 , 以获取完全选择的选项。 如果使用基于云的计算环境19 (材料表), 则在设置顺序运行时登录。点击 “测序” 上的 “测量” 页面上的。 下面的库变性18根据制造商的说明, 用荧光计14测量 DNA 库的浓度. 根据制造商的说明, 使用适当的自动电泳系统和 dna 质量分析工具包20 (材料表) 验证 dna 库质量。 要将 DNA 浓度从 ng/µL 转换为 nM, 请使用下面的公式16注: 平均库大小将特定于所使用的目标浓缩套件, 并可从电泳跟踪观察在步骤3.1.4。 根据制造商的说明21, 将排序库稀释到 6–20 pM 的最终浓度, 并按 600 ul 的容量进行。注: 所需的准确浓度取决于所使用的测序套件。请咨询浓缩套件制造商以确定适当的装载浓度。 根据制造商的说明, 稀释、变性和包括一个正控制序列库21。 记录每一个测序运行, 包括 DNA 库浓度加载 (pM), 增加阳性控制百分比, 试剂盒条码, 在步骤3.1.1 选择的应用, 索引读取数, 使用浓缩套件, 读取长度 (s) 和示例工作表名称。注意: 4–56桌面仪器的运行时间将取决于所选的仪器、浓缩套件和读取长度 (本实验中使用的排序器22)。 完成顺序运行后, 访问 “运行文件夹” (包括所有输出), 通过导航到 “”. 桌面仪表主页并单击 “管理文件”。将文件移动到本地驱动器以供以后访问。对于单独的选项, 在计算机上, 通过在导航面板上选择 “运行”, 在基于云计算的计算环境中查找文件19 。选择适当的排序运行以导航到 “运行摘要” 页。选择 “下载” 从云中获取数据。从出现的对话框中, 选择 FASTQ 文件作为要下载的文件类型, 然后单击 “下载”。 从基于云计算的计算环境19、23的 “运行摘要” 页中, 导航到 “图表”, 以分析计算环境所产生的各种数字所运行的排序的质量。有关生成的每个图形的详细信息, 请参阅制造商的说明23 。 从 “运行图表” 页中, 查找标记为 “按周期显示数据” 的数字。在 “图表” 下, 选择 “强度”, 并在 “通道” 下选择 “所有通道”。确保所产生的信号强度图类似于过去使用相同浓缩套件和。注: 这反映了每个基地在所有150个周期中显示的强度百分比。根据所使用的浓缩套件, 这个数字可能会有很大的差异, 这就是为什么必须将其与同一面板的过去顺序运行进行比较的原因。 在 “运行” 导航面板中选择 “索引 QC” 选项卡以查找页面右侧的索引质量控制 (QC) 直方图。确保在所有样本中观察到已识别的% 读数 (PF) 的相对均匀分布。注: 如果任何样本的% 读数都比其余样本低得多, 请注意, 测序数据的质量可能受到影响。 从基于云计算的计算环境的 “运行摘要” 页中, 通过单击 “运行” 导航面板中的 “度量” 来导航到质量指标。注意: 指标削减将取决于所使用的测序平台和浓缩套件。根据制造商的说明23可以使用许多度量标准, 下面的步骤突出显示了三的质量控制建议。 在 “密度 (K/毫米2)” 下, 确保簇密度位于所使用的浓缩套件建议的范围内 (在本例中为 1,200–1,4002)。 在 “%≥Q30” 下, 确保该值为≥85%, 反映顺序读取的质量。注: 如果低于此阈值 85%, 请注意, 排序的质量可能会受到损害。 在 “对齐 (%)” 下, 确保该值类似于序列化运行中包含的正控制的%。注意: 这是一种积极控制的措施, 只发现总读数的百分比与阳性对照基因组一致。如果使用1% 正控制, 则预期对齐 (%) 将是 ~ 1–5%。 图 1: 本技术软件 (材料表) 的截图示例表创建者应用程序选项.为了 ONDRISeq 的目的, 只使用 FASTQ 应用程序。但是, 如果用户希望生成其他文件 (如 VCF 文件), 建议使用目标重测序类别中的应用程序。请单击此处查看此图的较大版本. 4. 重测序和变体调用 对于数据预处理, 选择适当的软件将原始 FASTQ 文件与人类参考基因组对齐, 并调用变体 (材料表)。 导入 FASTQ 序列读入数据预处理软件。注: 为了 ONDRISeq 的目的, 通过软件导入和处理24个样本的单测序运行产生的 48 FASTQ 文件。一次处理的样品数量可以根据研究人员的需要和 “产品” 面板的大小而有所不同。 在 “导航区域” 中, 右键单击并选择 “新建文件夹”。为文件夹命名, 以便对执行的排序运行有明确的说明。 从顶部的工具栏中, 选择 “导入”。在顺序平台的下拉列表中, 选择了执行排序的平台。注: 为 ONDRISeq 的目的, 选择 “Illumina”。但是, 如果使用不同的排序平台, 请参考制造商关于 FASTQ 导入步骤24其余部分的说明。 在 “” 对话框中, 导航到正在处理的排序运行中的 FASTQ 文件并从中选择。如果使用具有多个服务器的计算机, 请确保正在导入的文件存储在本地驱动器中并从中导入。 从对话框的 “常规选项” 中, 单击 “配对读取” 旁边的框, 如果排序使用配对结束化学。注: 在这种情况下, 也应该有两个 FASTQ 样本导入每个样本-一个和一个反向。 从对话框的配对读取信息中, 如果前向读取 FASTQ 文件出现在文件列表中的反向读取之前, 请选择 “配对端 (正向反转)”。如果文件以相反的顺序出现, 请选择 “配对 (反向向前)”。将配对的读取最小距离设置为 1, 最大距离为 1000, 以便在样本序列内检测小规模结构重排。 从对话框的 “Illumina 选项” 中, 选择 “删除失败的读取”, 删除失败排序的读取。如果在导出 FASTQ 文件之前, “输出” 桌面工具取消复用数据, 则不选择 “MiSeq 反复用” 框。 从 “质量分数” 下拉列表中, 选择用于排序的 “产品” 管线。在对话框底部选择 “下一步”。注: 使用的管线将影响 FASTQ 文件质量分数的格式。有关选择哪个管线的详细信息, 请参阅制造商的说明24。 在 “新建” 对话框中, 选择 “保存” 和 “每浴单元创建子文件夹”, 将每个示例的 FASTQ 文件放入各自的文件夹中。在对话框底部选择 “下一步”。 在 “新建” 对话框中, 选择在步骤4.2.1 中创建的文件夹。这是将导入 FASTQ 文件的位置。在对话框的底部选择 “完成”, 然后等待 FASTQ 文件导入。单击 “进程” 选项卡以查看文件导入的状态。 根据制造商的说明, 在软件中设计工作流以执行重测序和变体调用。注意: 此工作流可能根据研究员的需要而异, 但以下步骤包括为 ONDRISeq (图 2) 的目的而包括的内容。此工作流中的步骤可以根据需要应用于其他重测序和变体调用软件。为 ONDRI 的目的, 所有生物信息学的处理都是参照人类参考基因组 GRCH37/hg19 进行的, 用于数据处理和分析的一致性。 将测序读数映射到参考基因组。 配置时, 根据需要选择参考基因组, 确保它与所有生物信息学步骤使用的参考基因组相同。 从掩蔽模式下拉列表中选择 “无掩蔽”, 以便不屏蔽引用序列的区域。 使用软件分配的默认映射选项。查看制造商的说明24以验证这是否可以根据研究的目的接受。 包括在工作流本地重新调整到人类参考基因组, 以解决任何读取映射错误, 特别是周围的插入删除变体。 使用软件分配的默认本地调整选项。查看制造商的说明24以验证这是否可以根据研究的目的接受。 删除由聚合酶协议内的 pcr 产生的重复映射读取, 以减少 pcr 放大偏倚的影响, 这可能产生误报25。 根据研究的需要, 设置 “少数群体序列的最大代表数 (%)”。注: 宽大设置, 如用于 ONDRISeq 的用途, 为 5%;但是, 软件的默认设置更严格20%。当两个读取非常相似时, 此设置确定是否应将具有较少读取计数的序列视为 PCR 放大偏差的排序错误。因此, 通过设置 5%, 少数读计数必须是≤5% 的多数读计数被改正与多数人读的相同。 从步骤4.3.3 中生成的读取曲目的覆盖率摘要文本文件的形式导出目标区域的统计信息。忽略设置中的非特定匹配项和断开的对。在本地驱动器上为这些文件选择一个目标。 从步骤4.3.3 中生成的读取曲目中导出每个示例的二进制序列对齐映射 (BAM) 文件。这包含序列对齐数据 (如果需要在将来的分析中)。在本地驱动器上为这些文件选择一个目标。 选择一个变体检测方法来调用序列中的变体。注: 当可以对样本的倍性进行假设时, 建议使用固定倍体变体检测算法, 如用于 ONDRISeq 的目的。如果无法进行此假设, 请参阅制造商的说明24确定最佳算法以供研究之用。 在配置时, 从固定倍性变体参数选项中, 为样本有机体设置倍性。设置 “必需的变体概率”, 或将变量正确调用以使其保留的概率为90.0%。 对常规筛选器使用以下建议设置: “最小覆盖率” 为 10x, “最小计数” 为 2, “最小读取频率” 为 20%, “忽略断开对”, 忽略非特定匹配 (基于 “读取”) 和 “最小读取长度” 20。注: 这些参数是基于 ONDRISeq 的目的。请参阅制造商的说明24以确保它们适合正在进行的研究。 使用以下建议设置的噪音过滤器: “基地质量过滤器” 与 “邻里半径” 映射质量分数为 5, “最低中央质量” 映射评分为 20, “最小邻里质量” 映射评分为 15;”读的方向过滤器” 5.0%;和 “相对读取方向过滤器” 的1.0% 意义。注: 这些参数是基于 ONDRISeq 的目的。请参阅制造商的说明24以确保它们适合正在进行的研究。 筛选根据浏览器可扩展数据 (床位) 文件所指定的与目标面板的目标区域重叠而调用的变体, 仅允许为目标的 “内部” 面板选择的基因组区域内发生的变体被保留.注: 该床文件将是唯一的目标的, 是正在使用的, 基于基因组的区域, 该小组可以覆盖。 从步骤4.3.7 中生成的变体轨道导出变体调用格式 (VCF) 文件中的变体报表。在本地驱动器上为这些文件选择一个目标。 根据制造商的说明24保存并安装工作流, 以使其在软件的 “工具箱” 中可用。确保将工作流命名为, 以便在将来明确它适合的 “it” 面板。 在安装过程中使用 “导出引用数据” 选项的对话框中, 将所有选项设置为 “捆绑”。 在安装过程中的 “安装位置” 选项的对话框中, 单击 “在本地计算机上安装工作流”。 根据制造商的说明24, 在步骤4.3 中设计的自定义生物信息学工作流中运行导入的 FASTQ 序列化读取文件。 标识软件 “工具箱” 中步骤4.3 中设计的工作流, 然后双击它。 在出现的对话框中, 找到在 “导航区域” 中的步骤4.2 中导入的 FASTQ 文件的文件夹。通过在 “导航区域” 中选择它们来突出显示所有文件夹, 然后单击 “批处理” 旁边的框。使用向右箭头将文件移动到 “选定元素”。单击对话框底部的 “下一步”。 在该对话框中, 查看 “批处理概述” 以确保选中了正确的 FASTQ 文件, 然后单击 “下一步”。 在对话框中查看工作流的以下步骤, 以确保在步骤4.3 中设计工作流时选择了正确的文件和导出位置: “映射读取到引用”;删除重复的映射读取 “;”为目标地区创造统计数据”;”出口 BAM”;”导出制表符分隔的文本”;”基于重叠的过滤器”;和 “出口 VCF” 在对话框中的最后一步-“结果处理”-选择 “在输入文件夹中保存” 选项。单击对话框底部的 “完成”。注意: 这意味着为每个示例生成的文件将被放置到在数据预处理软件中存储 FASTQ 文件的同一文件夹中。 图 2: 为 ONDRISeq 而自定义的数据预处理软件 (材料表) 内的 FASTQ 文件的重测序和变量调用工作流。工作流中的步骤可以根据研究者的需要应用到其他的重测序和变体调用软件中。请单击此处查看此图的较大版本. 5. 变体注释 下载并自定义注释变体 (ANNOVAR)26脚本, 以便在每个示例的 VCF 文件上执行变体批注。 从 ANNOVAR 下载以下数据库, 作为注解: 1) RefSeq27 (2015年8月更新);2) dbSNP13828 (2014年9月更新);3) Exome 聚合财团29 (才, 版本 0.3 2015年11月更新);4) 国家心脏、肺和血液研究所 Exome 测序项目欧洲队列30 (ESP, 2015年3月更新);5) 1000 基因组项目欧洲队列31 (1KGP, 2015年8月更新);6) ClinVar32 (2016年3月更新);和 7) 组合的注释依赖损耗33 (CADD), 从容错34 (筛选) 和 PolyPhen-235排序不耐受。注意: 基因组坐标和 ANNOVAR 引用的所有数据库都提到人类基因组构建 GRCh37/hg19。此外, 列出的数据库版本是用于 ONDRISeq 的, 当下载数据库时使用的是最新版本。 如果需要, 请自定义 ANNOVAR 输出注释变体的完整列表, 以及使用筛选操作26减少注释变体的编译。注: 减少名单可以根据研究员的需要定制。为 ONDRISeq 的目的, 被减少的注解的变形名单不包括比15个基地发生的变形从最近的外显子或任何变异与次要等位基因频率 (农林) > 3% 在三个数据库的任何: 1) 才;2) ESP;和 3) 1KGP。强烈建议使用此步骤。 如果需要, 根据研究员26的需要, 自定义 ANNOVAR 以单出特定的等位基因调用。注: 为了 ONDRISeq 的目的, ANNOVAR 评估为风险等位基因 rs429358 (c > t):p 所做的顺序调用. C130R 和 rs7412 (c > T):p. R176C 为了输出整个 APOE 基因型, 其中有六可能 组合, 包括: 1) E2/E2;2) E3/E2;3) E4/E2;4) E3/E3;5) E4/E3;6) E4/E4。在这六种可能的APOE基因型中, E4/E4 是发展晚发性阿尔茨海默病的最普遍接受的遗传危险因素36。 查询疾病变异数据库 (资料表), 以确定变种以前是否与疾病相关, 有合理的证据。请考虑以前未报告为新变体的任何变体。 评估来自 ClinVar 的 ANNOVAR 注释, 使与疾病相关的变种包括任何被归类为可能的致病或致病性。 过程拼接变体通过在硅片预测工具基于拼接的分析变体37 (SPANR) 和人剪接 Finder38 (HSF, 版本 3.0)。 如果处理大量示例, 请比较每个示例中的变体调用, 以确定哪些变体由各种示例共享。手动或使用自定义设计的脚本执行此操作, 以便检测可能的排序工件和污染事件。注意: 为了 ONDRI 的目的, 自定义脚本用于通过比较 ANNOVAR 输出文件来对它们进行注释。该脚本包含一个注释, 每个变体, 与任何其他样本的主题 ID 窝藏相同的变体, 否则称为变体的历史在研究队列。 根据美国医学遗传学学院 (ACMG) 致病性准则对变种进行分类39, 将每个变体分类指定为以下内容之一: 1) 致病性;2) 可能致病性;3) 不确定意义的变体;4) 可能良性;或 5) 良性。注意: 为了 ONDRI 的目的, 内部设计的 Python 脚本用于在半自动化的基础上执行 ACMG 分类。虽然不用于本研究, 但 InterVar40是一种类似设计的工具, 可以用类似的方式使用。 在研究队列 > 10% 中确定了 < 30x 和/或变体的序列覆盖范围内的任何变体, 以验证它们不是序列化工件41。