线粒体钙在分离线粒体和培养细胞中的流入分析

线粒体是胞内 Ca^{2 +}存储和信号传递的关键站点。数十年的研究表明, 线粒体有能力导入和隔离 Ca^{2 + 1,2}。但是, 线粒体不仅仅是 Ca^{2 +}存储的被动站点。在线粒体隔间的 Ca^{2 +}执行基本信号功能, 包括调节代谢输出和激活线粒体介导的细胞死亡通路, 此前已对³进行了回顾。对于代谢调节, Ca^{2 +}增强了 tricarboxylic 酸循环和呼吸链复合体的三基质局部化脱氢酶的活性, 以增加线粒体能量生产 4, 5.与线粒体 ca^{2 +}过载和失调线粒体 ca^{2 +}处理, Ca^{2 +}触发线粒体通透性过渡孔 (MPTP) 开放, 导致线粒体内膜通透,膜电位损失, 线粒体功能障碍, 肿胀, 破裂最终, 细胞死亡^6,7,8,9。因此, 线粒体 Ca^{2 +}信号直接影响细胞生命和死亡通路通过新陈代谢控制和 MPTP 死亡轴。

近年来, 对线粒体 ca^{2 +}动力学研究的兴趣迅速扩大, 大部分原因是线粒体 ca^{2 +} uniporter 复合体的分子成分的鉴定, 线粒体内作为 Ca^{2 +}的主要模式的膜传送器导入到线粒体矩阵^10,11,12。uniporter 的这些结构和调控亚基的鉴定提出了基因靶向线粒体 Ca^{2 +}流入调节线粒体功能和功能障碍的可能性, 并促进了研究uniporter 复合体和线粒体 Ca 的贡献^{2 +}流入疾病^13,14,15。事实上, 线粒体 Ca^{2 +}信号已牵连到多种疾病的病理, 从心脏病到变性, 癌症^{16,17,18, 19,20}。

考虑到线粒体 ca^{2 +}信号在新陈代谢和细胞死亡中的根本重要性, 并结合线粒体 ca^{2 +}信号影响的生物系统的广泛范围, 评估线粒体 ca^{2 + 的方法}涌入是非常有趣的。毫不奇怪, 测量线粒体 Ca^{2 +}的各种技术和工具已经开发出来。这些方法包括使用荧光 Ca^{2 +}敏感染料^21、22和基因编码的 Ca^{2 +}传感器 (如 cameleon 和 aequorin^{23) 等工具, 24}。本文的目的是突出显示可测量线粒体 Ca^{2 +}吸收的不同方法和模型系统。我们提出两种实验方法来评估线粒体 Ca^{2 +}涌入容量。以心肌线粒体为例, 我们详细介绍了一个基于平板阅读器的测量线粒体 ca^{2 +}摄取量的平台, 使用 Ca^{2 +}敏感染料钙 green-5N, 最适合于孤立的组织线粒体¹⁴.利用培养的 NIH 3T3 细胞, 我们还描述了一种基于共焦显微成像的检测方法, 用于测量透细胞中线粒体 Ca^{2 +} , 使用 Ca^{2 +}敏感染料 Rhod-2/AM²⁵。