Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca^{2 +} хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca^{2 + 1,2}. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca^{2 +} хранения. CA^{2 +} в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее³. Для регуляции метаболизма Ca^{2 +} усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства^4,5 . С митохондриальных Ca^{2 +} перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca^{2 +} обработка Ca^{2 +} триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти^6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.

В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca^{2 +} в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca^{2 +} Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca^{2 +} импорт в митохондриальной матрицы ^10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca^{2 +} приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca^{2 +} притока к болезни^13,14,15. Действительно митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на^{16,,1718, 19,20}.

Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca^{2 +} сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca^{2 +} . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca^{2 +}-чувствительных красители^21,22 и генетически закодированный Ca^{2 +} датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин^{23, 24}. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca^{2 +} поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с помощью Ca^{2 +} чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий¹⁴ . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клетки, с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM²⁵.