Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Mitochondriën zijn kritieke sites van intracellulaire Ca^{2 +} opslag en signalering. Decennia van onderzoek hebben aangetoond dat mitochondriën hebben de mogelijkheid om te importeren en sekwestreren Ca^{2 + 1,2}. Mitochondriën, zijn echter niet louter passieve sites van Ca^{2 +} opslag. CA^{2 +} bij de mitochondriale compartiment functies fundamentele signalering met inbegrip van de verordening van metabole output en activering van mitochondriale-gemedieerde cel dood trajecten, die al herzien eerder³. Voor de verordening van het metabole verbetert Ca^{2 +} de activiteit van drie matrix-gelokaliseerde dehydrogenases van de tricarboxylic acid cyclus evenals respiratoire ketencomplexen, te verhogen van mitochondriale energie productie^4,5 . Met mitochondriale Ca^{2 +} overbelasting en dysregulated mitochondriale Ca^{2 +} handling, Ca^{2 +} triggers mitochondriale permeabiliteit overgang porie (MPTP) openen, wat leidt tot mitochondriale binnenste membraan-permeabilization, membraan potentiële verlies, mitochondriale dysfunctie, zwelling, scheuren en uiteindelijk, cel dood^6,7,8,9. Dus, mitochondriale Ca^{2 +} signalering direct invloed zowel cellulaire leven en dood paden door metabole controle- en MPTP-dood as.

In de afgelopen jaren, er heeft zijn snel groeiende belangstelling voor de studie van mitochondriale Ca^{2 +} dynamiek gepast in groot deel aan de identificatie van de moleculaire bestanddelen van de mitochondriale Ca^{2 +} uniporter complex, een mitochondriale inner membraan-vervoerder die is een primaire modus van Ca^{2 +} importeren in de mitochondriale matrix ^10,11,12. Identificatie van deze structureel en regelgevend subeenheden van de uniporter heeft de mogelijkheid van genetisch targeting mitochondriale Ca^{2 +} toestroom te moduleren mitochondriale functie en dysfunctie voortgebracht en vergemakkelijkt de studie van de bijdrage van de uniporter complexe en mitochondriale Ca^{2 +} toestroom aan ziekte^13,14,15. Inderdaad, de mitochondriale Ca^{2 +} signalering heeft zijn betrokken bij de pathologieën van een divers scala aan ziekten, variërend van cardiale ziekte neurodegeneratie, en kanker^{16,17,18, 19,20}.

Gezien het fundamentele belang van mitochondriale Ca^{2 +} signalering in metabolisme en dood van de cel, en gecombineerd met het brede bereik van biologische systemen dat mitochondriale Ca^{2 +} signalering gevolgen, methoden voor het beoordelen van de mitochondriale Ca^{2 +} instroom zijn van groot belang. Niet verrassend, een verscheidenheid aan technieken en hulpmiddelen voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} zijn ontwikkeld. Deze omvatten methoden die gebruik maken van hulpmiddelen zoals fluorescerende Ca^{2 +}-gevoelige kleurstoffen^21,22 pt^{genetisch-gecodeerde Ca 2 +} sensoren gericht op de mitochondriën, zoals cameleon en aequorin^{23, 24}. Het doel van dit artikel is om te markeren van de verschillende methoden en modelsystemen waarin mitochondriale Ca^{2 +} opname kan worden gemeten. Presenteren we twee experimentele methoden voor de beoordeling van de mitochondriale Ca^{2 +} toestroom capaciteit. Cardiale mitochondriën als een voorbeeld gebruikt, we detail een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} opname met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof calcium groen-5N die ideaal geschikt is voor geïsoleerde weefsel mitochondria¹⁴ . Met behulp van gekweekte NIH 3T3 cellen, beschrijven we ook een confocale microscopie imaging gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca^{2 +} in permeabel cellen met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof Rhod-2/AM²⁵.