Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Todos los experimentos se llevaron a cabo conforme a los lineamientos establecidos por el Consejo de las comunidades europeas (Directiva 2010/63/UE del 04 de marzo de 2014) y fueron aprobados por el Ministerio italiano de salud. 1. diseño de microRNAs para ARN de interferencia y la evaluación de la eficiencia en sistemas de expresión heteróloga Nota: Este protocolo requiere un conocimiento de los siguientes métodos bien establecidos: clonación molecular, secuenciación de ADN, mantenimiento de líneas celulares, transfección del fosfato de calcio, cuantitativa real tiempo de PCR (qRT-PCR), preparación de Lisados celulares de líneas celulares y Western blotting. Determinar si el gen de interés es objeto de splicing alternativo. Para una caída general del gene, seleccionar exclusivamente constitutivos exones; para una caída de una isoforma específica alternativomente empalmada, seleccione el exón alternativamente empalmado pertinente. Utilizar software dedicado (por ejemplo, https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) para diseñar miRs artificiales para ARN de interferencia contra la secuencia de interés.Nota: Es importante utilizar una herramienta básica de búsqueda alineación Local (BLAST) para comprobar posibles de objetivos dentro de la misma especie. Seleccione las superior tres miRs ordenadas para el gene de la blanco. Ordenar los hilos superior e inferior de las miRs seleccionados de una empresa idónea. Para el control negativo, utilice una versión codificada de una las miRs seleccionados o un miR predijo no tratar ningún gen conocido de las especies utilizadas en el experimento (por ej. para los genes de vertebrados, el miR en pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg). Templar los respectivos hilos superior e inferior de miRs seleccionados y clonar en un plásmido diseñado para la expresión del miRs (e.g. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) utilizando estrategias de clonación estándar.Nota: El objetivo es crear un casete de expresión miR consistente en una 5′ miR región que flanqueaba, la secuencia de las miR y una 3′ miR que flanquean la región que puede expresarse del 3′ UTR de un gen reportero bajo el control de un promotor de RNA polimerasa tipo II. Secuencia de la DNA del uso para validar la correcta inserción de las miRs seleccionadas. Cultivar células HEK293 en una incubadora de cultivo celular humidificado (37 ° C, 5% CO2) con DMEM medio suplementado con suero bovino fetal 10%, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) y 1 x penicilina/estreptomicina (Pen/Strep). Cuando las células HEK293 confluentes de ~ 70%, co transfectar con cada uno de los vectores de expresión de la miR y un vector expresando el gen objetivo en una relación 1:1 de ADN mediante el método de fosfato de calcio6. Incluyen los siguientes controles: () untransfected las células, (ii) las células transfectadas con el vector expresando el gen objetivo junto con cualquier portador de ADN (por ejemplo, pBluescript II SK(+)) o (iii) Control de miR.Nota: (i) el gen objetivo expresado debe ser de la misma especie hacia la cual fueron diseñados los miRs, a menos que las secuencias dirigidas por las miRs se conservan absolutamente en el nivel de nucleótidos entre las dos especies. (ii) pueden utilizar líneas de la célula que no sea HEK293. (iii) otros métodos de transfección, como electroporación o métodos basados en liposomas, pueden ser utilizados. 48 h después de la transfección, lyse las células, ejecutar gel de proteínas, realizar Western blot y analizar contenido proteínico con un anticuerpo que reconoce la proteína diana. Objetivo para una eficiencia de precipitación de ≥50%.Nota: Eficiencia de precipitación puede alternativamente, o además, se evaluó (i) por análisis de ELISA, (ii) mediante la medición de la actividad de la proteína diana en su caso (por ejemplo densidades de corriente para canales iónicos) o (iii) por qRT-PCR a nivel de mRNA si conveniente los anticuerpos no están disponibles (paso 3 del Protocolo). Coloque los platos de la cultura en hielo y lavar las células una vez con helada solución salina con tampón fosfato (PBS). Aspirar el PBS, luego agregar helado almacenador intermediario RIPA (50 mM Tris-HCl de pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS), que contiene inhibidores de la proteasa y fosfatasa; 1 mL para un plato de Ø 100 mm, 0,5 mL para un plato de Ø 60 mm). Raspar las células adherentes el plato con un raspador celular y transferir suavemente la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga previamente enfriado. Centrifugar el tubo a 15.000 x g durante 15 min a 4 ° C, transferir el sobrenadante en un tubo nuevo de microcentrífuga previamente enfriado y descartar el precipitado. Determinar la concentración de proteína usando el kit de ensayo de proteína BCA u otro método adecuado (por ejemplo análisis de Bradford).Nota: Muestras pueden ser congeladas a-20 ° C o -80 ° C para su uso posterior, o procesadas inmediatamente. Transferir un volumen adecuado de lisados para tubos de microcentrífuga para que todas las muestras tienen la misma concentración de proteína y añadir tampón de lisis helada adecuada para compensar todos los lisados al mismo volumen.Nota: 30 a 50 μg de proteína total debe ser suficiente para la mayoría de las proteínas, pero la cantidad que se cargue debe determinarse según la abundancia de la proteína de interés. Agregar una cantidad apropiada de búfer de x Laemmli 2 (4% SDS, 10% 2-Mercaptoetanol, 20% glicerol, 0.004% bromofenol azul, 0.125 M Tris-HCl, pH 6,8) y hervir las muestras a 95 ° C durante 5 minutos. Cargar las muestras en un gel de acrilamida junto con un marcador de peso molecular. Correr el gel a 100 V por 1-2 h.Nota: El porcentaje del gel depende del tamaño de la proteína de interés. Montar el sándwich de traslado y transferencia de las proteínas desde el gel hacia una membrana a 100 V durante 2 h. Puede ser la membrana de nitrocelulosa o PVDF. Activar PVDF con metanol durante 1 min y lavar con tampón de transferencia antes de preparar la pila. Bloquear la membrana por 1 h a temperatura ambiente utilizando solución amortiguadora de bloqueo (5% de leche en SAFT (PBS + 0,1% Tween-20)), luego incubar la membrana durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario diluido en solución amortiguadora de bloqueo. Lavar la membrana por 10 min en SAFT tres veces e incubar con el anticuerpo secundario conjugado con HRP en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar la membrana por 10 min en PBS cuatro veces, luego el sustrato quimioluminiscente se aplica a la membrana y capturar las señales quimioluminiscencia utilizando a un sensor de cámara CCD. Utilizar software de análisis de imagen para cuantificar la eficacia de la precipitación. Seleccione los dos miRs más eficientes dirigidos a secuencias no superpuestos para ensayos más funcionales.Nota: Efectos de objetivos no pueden nunca ser totalmente descartadas por cualquier miR. Sin embargo, si dos miRs independiente tienen un efecto similar, es muy poco probable que esto es debido a una caída fuera del objetivo mismo. Si la eficiencia de precipitación de las miRs seleccionados no es satisfactoria (< 50%), la pantalla para otras miRs. Alternativamente, expresa la miR(s) más eficiente en tándem, es decir, expresarlos en copias múltiples del mismo cassette de expresión, que puede resultar en mayor eficiencia de precipitación7. 2. construcción de vectores combinados expresión de Optogenetic sondas y microRNAs recombinante Adeno-asociado Nota: Este protocolo requiere un conocimiento de los siguientes métodos bien establecidos: clonación molecular, secuenciación de DNA y producción de rAAV. Copia de los cassettes de expresión miR más eficientes en el 3′ UTR de construcciones diseñadas para producción de recombinantes rAAVs y expresión de los optogenetic las puntas de prueba, tales como pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figura 1A), donde el promotor sinapsina enolase unidades de expresión de la ultrarrápida channelrhodopsin ChETA, reportero fluorescente rojo TdTomato y miR(s) entre los sitios de NheI y EcoRI5.Nota: (i) no superan el límite de empaquetado de rAAVs, que es aproximadamente 4,7 Kb en longitud de ITR (repetición terminal invertida) a ITR (figura 1A, naranja). (ii) el casete de expresión miR tiene que ser insertado entre el codón de parada y WPRE (elemento postranscripcional del regulador de la Virus de la Hepatitis de marmota; Figura 1A). (iii) inclusión de una proteína fluorescente, como TdTomato, es muy útil ya que permite para monitorear fácilmente la localización y la intensidad de la infección (paso 4 del Protocolo). Utilice la secuencia de la DNA para validar la correcta inserción de los casetes miR. Productos y título rAAV1/2 según el protocolo anteriormente publicado8, rAAV1/2 para cada seleccionado miR. Un experimento típico para la caída de un gene incluiría dos miRs independiente contra el mismo gen y el control de un miR. Busca un título de virus de genomas virales de ≥ 109 (vg) / μl.PRECAUCIÓN: rAAVs necesita ser manejado en una instalación de nivel de bioseguridad 1 (BSL-1). Para obtener información detallada, consulte con Comité de bioseguridad institucional.Nota: Si el laboratorio no cuenta con un servicio viral o títulos virales no son satisfactorios, producción de rAAV puede ser subcontratado. Por ejemplo, visite https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ o https://vcf.charite.de/en/metas/. 3. extracción de RNA a partir de cultivos primarios neuronales para la evaluación del miR eficiencia Knockdown de Genes endógenos por qRT-PCR Nota: (i) este protocolo requiere un conocimiento de los siguientes métodos bien establecidos: preparación y mantenimiento de cultivos neuronales primarios y qRT-PCR. (ii) repetir la cuantificación de la eficiencia de precipitación (pasos 3.1 – 3.14) al menos 3 veces (Replica biológica). (iii) estimación de la eficiencia de precipitación a nivel de mRNA por qRT-PCR es conveniente cuando un análisis del contenido proteínico queda excluido, como cuando tumbaron alternativamente empalmados isoformas que anticuerpos específicos no están disponibles5. Preparar cultivos neuronales primarios de la región cerebral de interés. Seguir el protocolo para las culturas corticales en anterior publicación9, con las siguientes modificaciones: Neuronas de la placa en 6 placas de pozos a una densidad de 500.000 neuronas por pozo. Utilizar 2,5 mL/pozo del medio de fijación y 3,3 mL/pozo de medio de mantenimiento. Si se observa un crecimiento excesivo de astrositos, Añadir 0,5 mL/pozo de medio de mantenimiento suplementado con 7.5 μm de citosina β-D-arabinofuranoside (para una concentración final de 1 μm) en 3-4 días en vitro (DIV). Infectar a tres pozos por miR (técnica replica) en 5-6 DIV. utilizar la menor dosis infecciosa que infectará el ≥99% de las neuronas. Retirar 2 mL del medio de cada pozo y recoger en un tubo falcon de 50 mL. Añadir virus directamente a las neuronas, mezclar suavemente y volver a colocar las placas en la incubadora a 37 ° C. Almacenar el medio recogido en la incubadora. Flojo el tapón del tubo del halcón para permitir el equilibrio del gas. Después de 24 h, añadir el medio quitado de nuevo en cada pozo (1,9 mL/pocillo). En 17,18 DIV, lyse las neuronas para la extracción de RNA.PRECAUCIÓN: Reactivo de lisis y cloroformo son altamente tóxicos. Trabajar bajo una campana química y usar equipo de protección; disponer de los residuos según sus directrices nacionales e institucionales.Nota: Para medidas 3.3 – 3.13, trabajo en condiciones libres de Rnasa. Utilice guantes y utilizar libre de Rnasa cristalería y recipientes de plástico desechables. Precauciones generales sobre cómo mango RNA, consulte por ejemplo Apéndice A del manual Micro RNeasy disponibles en línea. Incubar de vidrio, que pipetas de Pasteur durante la noche en un horno a 180 º C. Inclinación de las placas y aspirar el medio de cada pocillo con un pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío de vidrio totalmente. Inmediatamente añadir 700 μl de reactivo de lisis para cada pozo. Distribuir uniformemente la solución por balanceo y agitar la placa con cuidado y brevemente con la mano. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo 4 a 5 veces o hasta obtener una suspensión homogénea. Transferir la solución de cada pozo en un separado tubo Eppendorf de 1,5 mL.Nota: Los lysates de la célula pueden ser almacenadas a-80 ° C o procesado inmediatamente. Si es necesario, descongelar células lisados en RT y proceder de inmediato a paso 3.5. Añadir 140 μl de cloroformo a cada muestra de lysates de la célula.Nota: El cloroformo es volátil y difícil de la pipeta, cerrar los tubos Eppendorf tan pronto como sea posible. Agite los tubos Eppendorf vigorosamente durante 15 s o hasta que las muestras son totalmente emulsionadas. Mantener la muestra a temperatura ambiente durante 1-2 minutos o hasta que el líquido fases comienzan a separarse. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior (~ 320 μL) que contienen RNA a un tubo Eppendorf nuevo y deseche el líquido restante.Nota: No toque la fase orgánica rosa inferior o el anillo blanco entre las dos fases con la punta de la pipeta. Añadir 1,5 volúmenes de etanol al 100% (480 μL) a la fase acuosa, y pipetear la solución lentamente arriba y abajo 3 veces para mezclar. Purificar el RNA usando un kit disponible en el mercado diseñado para la purificación del ARN de muestras pequeñas. Cuantificar la pureza de concentración y de la muestra de RNA con un espectrofotómetro.Nota: (i) esperar rendimientos de ≥3.5 μg/pocillo; 260/280 y 260/230 proporciones de pureza sobre proteínas y compuestos orgánicos debe ambos ser ≥1.9. (ii) las muestras de RNA pueden ser almacenadas a-80 ° C o procesadas inmediatamente. Retrotranscribe 250, 500 o 1000 ng de ARN con un kit disponible comercialmente. Cuantificar la eficiencia de precipitación para el gen endógeno de interés por qRT-PCR. Para un protocolo detallado, ver referencia10. Aspirar a una eficiencia de precipitación de ≥60% (figura 2). Normalizar los datos a los genes housekeeping ≥2 (por ej. GAPDH, ACTB, TUBB3 PPIA) utilizando los múltiples control interno gene método11.Nota: Si trabaja en rata, utilice los siguientes iniciadores PCR para los genes housekeeping: GAPDH fwd: 5′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3′ y GAPDH-rev: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′; ACTB-fwd: 5′ CATCACTATCGGCAATGAGC 3′ y ACTB-rev: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′; TUBB3-fwd: 5′ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3′ y TUBB3-rev: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′; PPIA-fwd: 5′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3′ y PPIA-rev 5′ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3′. 4. evaluación del papel de las proteínas presinápticas en circuitos neuronales intactas por estimulación específica de las neuronas derribado con Optogenetics Nota: El siguiente protocolo requiere experiencia previa con las grabaciones electrofisiológicas en rebanadas de cerebro agudo y el acceso a una instalación electrofisiológico. Stereotactically inyectar rAAV1/2 cerebro siguiendo un protocolo detallado en la publicación anterior12. Determinar las coordenadas stereotactic de la región cerebral de interés utilizando Atlas estereotácticos para ratón13 o rata cerebro14. Utilizar un extractor de la micropipeta para Micropipetas de inyección con caña larga de Ø 7 – 9 μm; clip las Micropipetas de inyección en la caña con unas tijeras. Use un marcador fino y papel cuadriculado para colocar marcas de calibración de las Micropipetas de inyección cada 2 mm. Anestesiar los animales con isoflurano y fijar en el aparato estereotáctico. Mantener el animal caliente a lo largo de la operación con una almohadilla térmica a 37 ° C. Proteger los ojos con lubricante ocular. Afeitar el pelo en la cabeza con una afeitadora eléctrica. Difundir el yodo povidona en la cabeza rapada con un bastoncillo de algodón. Con un microscopio de disección, haga una incisión de línea media. Limpie la superficie del cráneo con un bastoncillo de algodón, para visibilizar el bregma y lambda. Colocar la micropipeta de inyección en su soporte. Instale el soporte al brazo estereotáctico. Determinar x e y coordenadas del sitio de la inyección en comparación con el bregma y el lambda. Use un taladro para diluir el cráneo sobre el área de destino.Nota: Utiliza movimientos circulares suaves y evitar la perforación a través del cráneo, esto dañará la superficie del cerebro. Si hay sangrado, absorber el exceso de sangre con papel toalla.Nota: Exceso de sangre hará difícil determinar correctamente la coordenada z. Carga ≤ 2 μl de virus en la micropipeta de inyección por la acción capilar. Traer la micropipeta de inyección a x e y coordenadas del sitio de la inyección. Calcular la coordenada z de la duramadre y baje lentamente la pipeta en el cerebro. Al llega a la coordenada z, esperar 3 minutos para permitir el ajuste del tejido. Aplicar baja presión positiva utilizando una jeringa de 1 mL conectada mediante un tubo flexible en la parte posterior de la micropipeta de inyección. Controlar visualmente la velocidad de eyección del virus de la micropipeta de inyección a través del microscopio de disección y uso de las marcas de calibración de puntos de referencia.Nota: Virus tiene que ser inyectado a ritmo lento (< 100 nL/min) para evitar daño tisular. Una vez terminada la inyección, esperar 5 min, retirarse de la micropipeta de inyección de 0,2 mm, espere otros 5 minutos, para evitar el reflujo de los virus. Retirarse la micropipeta de inyección lenta y completamente el cerebro y disponer de él en un recipiente llenado de blanqueador. Moje el cráneo con solución fisiológica y suturar la piel con 3-4 puntos. Aplicar ungüento de gentamicina a la herida. Solo el animal en una jaula limpia con alimento pellets y bajo una lámpara de calor hasta que se recupere completamente. ≥ 15 días después de la inyección, decapitar a los animales bajo anestesia isoflurano profundo. Elaborar rebanadas de cerebro agudo de la región cerebral de interés con un Vibratome usando gas (95% O2, 5% CO2) solución helada aCSF, que contiene (en mM): NaCl 123, 1.25 1.25 KH2PO4, 1.5 MgCl2, KCl, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, NaPyruvate 2 y 18 glucosa (osmolaridad ajustada a 300 mOsm). Por ejemplo, si el objetivo es analizar la transmisión sináptica de CA3 a neuronas piramidales de CA1, prepare rebanadas sagitales de la formación hipocámpica (350 μm de espesor).Nota: De este paso adelante trabajan bajo condiciones de poca luz para evitar la activación de la sonda de optogenetic por la luz ambiental. Deje que las rebanadas de recuperar durante 30 min a 37 ° C en la aCSF mismo en un compartimiento diseñado para la celebración de cortes de cerebro. Mantener las rodajas en la misma cámara de trozo de cerebro a temperatura ambiente hasta la grabación.Nota: Con estas condiciones, rebanadas pueden mantenerse saludables para un máximo de 6-8 h. Transferencia una rebanada y una cámara de grabación sumergida superfuse con 2 mL/min de la aCSF mismo utilizado para la recuperación con 1,5 mM de CaCl2 (total de Ca2 +: 2, 5 mM) y sin NaPyruvate.Nota: Rebanadas son preparadas y mantenidas en baja concentración de Ca2 + (1 mM) para reducir al mínimo la toxicidad. Las grabaciones se realizan en 2,5 mM Ca2 + para favorecer la liberación de la vesícula. Comprobar brevemente la señal del reportero fluorescente expresa (por ejemplo. TdTomato; Figura 3B) para determinar la localización y la intensidad de la infección. Se llenan de un electrodo parche una solución intracelular que contiene (en mM): 110 K-gluconato, 22 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, Na 0,5, 0,5 EGTA, KCl, NaCl 53-GTP, 20 K2-fosfato de creatina, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 mΩ).Nota: Use parche electrodo con una resistencia de la pipeta de 5-6 mΩ. Bajo iluminación infrarroja, llegar a sello hermético celulares configuración desde una neurona recibir entradas sinápticas de las neuronas infectadas. Por ejemplo, si se infectaron neuronas piramidales CA3, remiendo de neuronas piramidales en la proximal a la zona medial de la región CA1 (figura 3).Nota: Resistencia en serie se puede dejar sin compensación, pero debe ser constante y baja (≤20 MΩ). Use farmacología para aislar las corrientes sinápticas bajo investigación. Por ejemplo, si el objetivo es investigar la transmisión sináptica excitatoria, bloquean la transmisión sináptica inhibitoria con 10 μm bicuculina. Evocan las corrientes sinápticas, por ejemplo, corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs), usando un laser de nm azul 473 acoplada a una fibra óptica (Ø ≤250 μm), colocada en los Somas de las neuronas infectadas (por ejemplo. Neuronas piramidales CA3). Ajustar longitud de estimulación al mínimo, para reducir la posibilidad de que más de un potencial de acción por pulso de luz. Si usa el ChETA, colóquela a 2 ms15. Ajustar la fuerza de la estimulación del láser para producir las corrientes sinápticas pequeñas pero claramente perceptibles (≤50 amplitud de pico de pA para EPSCs grabado en un potencial de explotación de -70 mV entre neuronas piramidales CA3 y CA1; Figura 3D). Si usa ChETA y una fibra óptica de 250 μm de diámetro, estimulación salir fuerzas de 1 a 3 mW en la fibra debe ser adecuada.Nota: si fuerza de láser no puede ser regulado, usar filtros de densidad neutra. Iluminar los 473 nm láser en los Somas de las neuronas infectadas, pero no en sus axones. Por ejemplo, brillar la luz en CA3 somata y lejos de los collaterals de Schaffer, para evitar la despolarización directa de los axones. Tetrodotoxin (TTX; 0,5 μm) se aplica, un bloqueador de canales de sodio, a la muestra para confirmar los canales están impulsados por el potencial de acción. En diferentes grabaciones, aplicar un bloqueador selectivo a la corriente sináptica bajo investigación para confirmar la estimulación selectiva.Nota: por ejemplo, aplicar NBQX (10 μm) a glutamato tipo AMPA receptor mediada por EPSCs. Comparar las corrientes sinápticas ópticamente y eléctricamente evocadas en el mismo segmento cerebral aguda en respuesta a la estimulación repetitiva (≥ 2 estímulos en ≤20 Hz). Un grado similar de facilitación sináptica o depresión debe observarse entre la estimulación eléctrica y óptica cuando se utiliza un miR de control, por lo tanto, lo que sugiere que mecanismos similares de celulares son activados por los dos tipos de estímulos.Nota: Los pasos anteriores son necesarios para asegurar que la estimulación óptica no induce una despolarización directa de botones presinápticos, obviando algunos mecanismos de transmisión sináptica. Comparar la transmisión sináptica en respuesta a estímulos simples y repetitivos (≥ 2 estímulos en ≤20 Hz) entre un miR control y miRs a las proteínas presinápticas bajo investigación.