Kombinere Optogenetics med kunstig microRNAs å karakterisere effekter av Gene Knockdown Presynaptic funksjonen i intakt nevrale kretser

Alle eksperimentene ble utført i samsvar med retningslinjene som er fastlagt av det europeiske fellesskap råd (direktiv 2010/63/EU 4 mars 2014), og ble godkjent av italiensk Helsedepartementet. 1. tegning av microRNAs for RNA-interferens og evaluering av effektiviteten i Heterologous uttrykk Merk: Denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: molekylære kloning, DNA sekvensering, vedlikehold av linjer, kalsium fosfat transfection, kvantitativ real tid PCR (qRT-PCR), utarbeidelse av celle lysates fra linjer og vestlige blotting. Avgjøre om genet av interesse er underlagt alternativ skjøting. For en generell knockdown av genet, Velg utelukkende grunnleggende exons; for en knockdown av et bestemt alternativt skjøtes isoformen, velger du den relevante alternativt skjøtes exon. Bruk dedikert programvare (f.eks https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) å utforme kunstig miRs for RNA-interferens mot sekvensen av interesse.Merk: Det er viktig å bruke en grunnleggende lokale justering Søk verktøyet (BLAST) for å se etter mulige av mål innenfor samme art. Velg de øverste tre rangert miRs for målet genet. Bestill de øverste og nederste trådene de valgte miRs fra et egnet selskap. Hvis negativ kontroll, bruker du en kryptert versjon av de valgte miRs eller en miR spådd ikke for å målrette alle kjente genet av arten brukes i eksperimentet (f.eks. for virveldyrenes gener, miR i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg). Anneal de respektive topp- og trådene av de valgte miRs og klone dem i en plasmider designet for uttrykk for miRs (f.eks pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) standard kloning strategier.Merk: Målet er å opprette en miR uttrykk kassett bestående av en 5′ miR flankemanøveren region, valgte miR sekvensen og en 3 miR flankemanøveren region som kan uttrykkes fra den 3-‘ UTR i med et reporter under kontroll av en RNA polymerase type II promoter. Bruk DNA sekvensering for å validere riktig innsetting av de valgte miRs. Vokse HEK293 celler i en fuktet celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) bruker DMEM medium supplert med 10% fosterets bovin serum, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) og 1 x penicillin/streptomycin (penn/Strep). Når HEK293 celler er ~ 70% confluent, co transfect dem med hver av miR uttrykk vektorer og en vektor uttrykke målrettet genet i 1:1 DNA forholdet bruker kalsium fosfat metode6. Inkluderer følgende kontroller: (i) untransfected celler, (ii) celler transfekterte med vektoren uttrykke målrettet genet sammen med enten bærer DNA (f.eks pBluescript II SK(+)) eller (iii) miR kontroll.Merk: (i) uttrykte målrettet genet må være fra samme art mot miRs ble utformet, med mindre sekvenser målrettet av miRs er helt bevart på nukleotid nivå mellom de to artene. (ii) cellelinjer enn HEK293 kan brukes. (iii) alternative metoder for hva, for eksempel electroporation eller liposome-baserte metoder, kan brukes. 48 timer etter transfection, lyse cellene, kjøre protein gel, utføre Western blot og analysere protein innhold med et antistoff gjenkjenne mål protein. Mål for en knockdown effektivitet på ≥50%.Merk: Knockdown effektivitet kan alternativt eller i tillegg evalueres (i) ved ELISA analyse, (ii) ved å måle aktiviteten til målet protein eventuelt (f.eks gjeldende tettheter for ionekanaler) eller (iii) ved qRT PCR på mRNA nivå hvis egnet Antistoffene er ikke tilgjengelig (protokollen trinn 3). Plasser kultur rettene på is og vaske cellene gang med iskald fosfat-bufret saltvann (PBS). Sug opp PBS Legg iskald RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% natrium dodecyl sulfate (SDS), som inneholder protease og fosfatase hemmere, 1 mL for et fat av Ø 100 mm, 0,5 mL for et fat av Ø 60 mm). Skrape tilhenger celler av fatet med cellen skraper og overføre forsiktig celle suspensjon i en pre-avkjølt microcentrifuge tube. Sentrifuge røret på 15.000 x g i 15 min på 4 ° C, overføre nedbryting i en ny pre-avkjølt microcentrifuge tube og kast pellet. Bestemme protein konsentrasjonen BCA Protein analysen kit eller andre egnet metode (f.eks Bradford analysen).Merk: Utvalg kan enten frosset ved 20 ° C eller-80 ° C for senere bruk, eller behandlet umiddelbart. Overføre en passende mengde lysates til microcentrifuge rør slik at alle har samme protein konsentrasjonen og legge tilstrekkelig iskald lyseringsbuffer utgjør alle lysates til samme volum.Merk: 30 til 50 µg totale protein burde være nok for de fleste av proteiner, men riktig mengde lastes bør fastsettes etter overflod av protein av interesse. Legge til en passende mengde 2 x Laemmli buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glyserol, 0.004% bromophenol blå 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8) og kok prøvene ved 95 ° C i 5 minutter. Last eksemplene på en akrylamid gel med merketråd molekylvekt. Kjøre gel på 100 V for 1-2 h.Merk: Ønsket gel, avhenger av størrelsen på protein av interesse. Montere overføring sandwich og overfører proteiner fra gel på en membran 100 V 2 h. Membranen kan være nitrocellulose eller PVDF. Aktivere PVDF med metanol for 1 min, og skyll den med overføring buffer før forberede stakken. Blokkere membranen 1t ved romtemperatur bruker blokkerer buffer (5% melk i PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), deretter ruge membranen overnatting på 4 ° C med primære antistoff fortynnet i blokkering buffer. Vask membranen i 10 min i PBST tre ganger og ruge det med HRP-konjugerte sekundære antistoff blokkerer buffer 1t ved romtemperatur. Vask membranen i 10 min i PBS fire ganger, deretter bruke chemiluminescent underlaget membranen og ta chemiluminescent signalene med en CCD kamera-baserte imager. Bruk image analyseprogramvare for å kvantifisere knockdown effektiviteten. Velg de to mest effektive miRs rettet mot ikke-overlappende sekvenser for ytterligere funksjonelle analyser.Merk: Av mål effekter kan aldri være helt utelukket for noen miR. Men hvis to uavhengige miRs har en lignende effekt, er det svært usannsynlig at dette skyldes en samme off-målet knockdown. Hvis pusse effektiviteten av de valgte miRs ikke er tilfredsstillende (< 50%), skjermen for andre miRs. Alternativt uttrykke uttrykke de mest effektive miR(s) i tandem, dvs dem i flere kopier av samme uttrykket kassetten, som kan resultere i økt knockdown effektivitet7. 2. bygging av rekombinant Adeno-assosiert vektorer for kombinert uttrykk av sonder Optogenetic og microRNAs Merk: Denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: molekylære kloning, DNA sekvensering og rAAV produksjon. Klone av mest effektive miR uttrykk kassettene inn den 3-‘ UTR i av konstruksjoner utviklet for produksjon av rekombinant rAAVs og uttrykk for eksitatoriske optogenetic sonder, som pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figur 1A), hvor den Nevron-spesifikke synapsin promoter stasjoner uttrykk for den lynraske channelrhodopsin ChETA, røde fluorescerende reporter TdTomato og miR(s) settes inn mellom NheI og EcoRI områder5.Merk: (i) ikke overstige emballasje grensen på rAAVs, som er omtrent 4,7 Kb i lengde fra ITR (invertert terminal gjenta) til ITR (figur 1A, oransje). (ii) miR uttrykk kassett må settes mellom stopp codon og WPRE (hakkespett hepatitt Virus Posttranscriptional regulatorisk Element; Figur 1A). (iii) inkludering av en fluorescerende protein, som TdTomato, er svært nyttig fordi det gir lett overvåking lokalisering og intensiteten av infeksjon (protokollen trinn 4). Bruk DNA sekvensering for å validere riktig innsetting av miR kassettene. Produsere og titer rAAV1/2 etter de tidligere publiserte protokoll8, en rAAV1/2 for hver valgte miR. En typisk eksperiment for knockdown av genet omfatter to uavhengige miRs mot det samme genet og en miR kontroll. Mål for en virus titer av ≥109 viral genomer (vg) / µL.Advarsel: rAAVs må håndteres i biosikkerhet nivå 1 (BSL-1) anlegg. Ta kontakt med institusjonelle Biosafety utvalget for detaljert informasjon.Merk: Hvis laboratoriet ikke har en viral anlegget eller hvis viral titers ikke er tilfredsstillende, rAAV produksjon kan bli outsourcet. Gå for eksempel https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ eller https://vcf.charite.de/en/metas/. 3. utvinning av RNA fra primære Neuronal kulturer for evaluering av miR Knockdown effektiviteten av endogene gener av qRT PCR Merk: (i) denne protokollen krever kunnskap om veletablerte metodene: forberedelse og vedlikehold av primære neuronal kulturer og qRT PCR. (ii) gjenta kvantifiseringen knockdown effektivitet (trinn 3.1-3.14) minst 3 ganger (biologiske gjentak). (iii) estimering av knockdown effektivitet på mRNA nivå av qRT PCR er egnet når en analyse av proteininnholdet er utelukket, for eksempel når banket ned alternativt skjøtes isoformene som spesifikke antistoffer ikke er tilgjengelig5. Forberede primære neuronal kulturer fra hjernen regionen rundt. Følg protokollen for kortikale kulturer i forrige publikasjonen9, med følgende endringer: Plate nerveceller i 6 bra plater på en tetthet av 500.000 neurons per brønn. Bruk 2,5 mL/vel vedlegg medium og 3.3 mL/vel av vedlikehold medium. Hvis astrocytter overvekst er observert, legge 0,5 mL/godt vedlikehold medium med 7,5 µM av cytosine β-D-arabinofuranoside (for en siste konsentrasjon på 1 µM) på 3-4 dager i vitro (DIV). Infisere tre brønner per miR (teknisk gjentak) på 5-6 DIV. Bruk den laveste smittsomme dosen som vil infisere ≥99% av neurons. Fjerne 2 mL medium fra hver brønn og samle den i en 50 mL falcon rør. Legge til virus direkte neurons, bland forsiktig og plassere plater tilbake i inkubator på 37 ° C. Lagre samlet mediet i inkubator. Løs hetten falcon røret å tillate gass balanse. Etter 24 h, Legg den fjernet medium ryggen i hver brønn (1,9 mL/vel). På 17-18 DIV, lyse neurons for RNA utvinning.Advarsel: Lysis reagens og kloroform er svært giftig. Arbeid under kjemiske hette og Bruk verneutstyr; Kast avfall i henhold din nasjonale og institu-retningslinjer.Merk: Hva 3.3-3,13, fungerer i RNAse-gratis forhold. Bruk hansker og bruk RNAse-free glass og disponibel plasticware. For generelle forholdsregler om hvordan å håndtere RNA, se for eksempel tillegg A i RNeasy mikro håndboken tilgjengelig online. Inkuber glass Pasteur Pipetter over natten i en ovn ved 180 ° C. Tilt platene og Sug opp mediet helt hver godt med et glass Pasteur pipette koblet til en vakuumpumpe. Straks legge 700 µL av Lysis reagensen i hver brønn. Jevnt løsningen ved rock og riste platen nøye og kort for hånd. Pipetter løsningen opp og ned 4-5 ganger eller til en homogen suspensjon er oppnådd. Overføre løsningen fra hver brønn i en separat 1,5 mL Eppendorf tube.Merk: Cellen lysates kan lagres ved-80 ° C eller behandlet umiddelbart. Hvis nødvendig, avise celle lysates på RT og videre umiddelbart til trinn 3.5. Legge til 140 µL av kloroform hvert utvalg fra celle lysates.Merk: Kloroform er flyktig og vanskelig å Pipetter, nær Eppendorf rør så snart som mulig. Riste Eppendorf rør godt i 15 s eller til prøvene er fullt emulgert. Holde prøven på RT i 1-2 min eller til flytende fasene begynner å skille. Sentrifuge prøvene 12.000 x g i 15 min på 4 ° C. Overføre den øvre vandige fasen (~ 320 µL) inneholder RNA til en ny Eppendorf tube, og forkaste gjenværende væsken.Merk: Ikke berør den lavere rosa organiske fasen eller hvit ringen mellom de to fasene med spissen av pipette. Legge til 1,5 mengder 100% etanol (480 µL) i den vandige fasen og Pipetter løsningen langsomt opp og ned 3 ganger å blande. Rense RNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit utviklet for rensing av RNA fra små prøver. Kvantifisere RNA konsentrasjon og prøve renhet med et spektrofotometer.Merk: (i) forventer gir ≥3.5 µg/godt; 260/280 og 260/230 prosenter for renhet over proteiner og organiske forbindelser bør være ≥1.9. (ii) RNA prøver kan lagres ved-80 ° C eller behandlet umiddelbart. Retrotranscribe 250 500 og 1000 ng av en kommersielt tilgjengelig Kit. Kvantifisere knockdown effektiviteten for endogene genet av interesse av qRT PCR. For en detaljert protokoll, kan du se referanse10. Mål for en knockdown effektiviteten til ≥60% (figur 2). Normalisere dataene ≥2 housekeeping gener (f.eks. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) bruke flere internkontroll genet metode11.Merk: Hvis arbeider i rotte, bruk de følgende PCR primerne for housekeeping gener: GAPDH-fwd: 5′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3 og GAPDH-rev: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′; ACTB-fwd: 5′ CATCACTATCGGCAATGAGC 3 og ACTB-rev: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′; TUBB3-fwd: 5′ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3 og TUBB3-rev: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′; PPIA-fwd: 5′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3 og PPIA-rev 5’ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3. 4. vurdere rollen Presynaptic proteiner i intakt nevrale kretser av målrettet stimulering av banket-ned Neurons med Optogenetics Merk: Følgende protokollen krever tidligere erfaring med elektrofysiologiske innspillinger i akutt hjernen skiver og tilgang til en elektrofysiologiske oppsett. Stereotactically injisere rAAV1/2 i hjernen etter en detaljert protokoll i forrige publikasjonen12. Bestemme stereotactic koordinatene for hjernen regionen rundt med stereotactic Atlas for musen13 eller rotte hjernen14. Bruk en brønnene avtrekker for å trekke injeksjon Mikropipetter med lang shanks av Ø 7 – 9 µm; klipp injeksjon Mikropipetter på marrowbones med saks. Bruk en tynn markør og millimeterpapir plassere kalibrere merker på injeksjon Mikropipetter hver 2 mm. Bedøve dyret med isoflurane og fikse det i stereotactic apparatet. Holde dyr varme hele operasjonen med en varmeputen satt på 37 ° C. Beskytte øynene med okulær smøremiddel. Barbere pelsen på hodet med en elektrisk barberhøvel. Spre povidon jod på barberte hodet med en bomullspinne. Under dissecting mikroskop, gjør en midtlinjen snitt. Flaten skallen med en bomullspinne, for å gjøre bregma og lambda synlig. Plass injeksjon brønnene i eieren. Koble holderen til stereotactic armen. Angi x- og y-koordinatene til injeksjonsstedet i forhold til bregma og/eller lambda. Bruk en drill for å tynne skallen over målområdet.Merk: Bruk forsiktige sirkelbevegelser og unngå boring gjennom skallen da dette vil skade overflaten av hjernen. Hvis det er blødning, absorbere overdreven blod med håndkle papir.Merk: Overdreven blod vil gjøre det vanskelig å fastslå riktig z koordinater. Legg ≤2 µL av virus i injeksjon brønnene kapillær handling. Bringe injeksjon brønnene til x- og y-koordinatene til injeksjonsstedet. Beregne den z-koordinaten fra dura og lavere pipette sakte inn i hjernen. Når den z-koordinaten vente 3 min å tillate vev justering. Bruk lav positive trykk bruker en 1 mL sprøyte koblet via en fleksibel slange til baksiden av injeksjon brønnene. Visuelt overvåke hastigheten på utstøting av viruset fra injeksjon brønnene gjennom disseksjon mikroskopet og bruker kalibrere merkene som referansepunkt.Merk: Virus må være injisert med treg hastighet (< 100 nL/min) å unngå skade på vev. Når injeksjon er fullført, vent 5 min, trekke injeksjon brønnene av 0.2 mm, vente på en annen 5 min, å unngå tilbakestrømming av viruset. Trekke injeksjon brønnene sakte og helt fra hjernen og kast i en container fylt med blekemiddel. Våt skallen med fysiologiske løsning og Sutur i huden med 3-4 masker. Gentamicin salve gjelde såret. Single-huset dyr i et rent bur med mat pellets og under en varmelampe til det gjenoppretter fullt. ≥15 dager etter injeksjon, halshugge dyr under dyp isoflurane anestesi. Forberede akutt hjernen skiver av hjernen regionen rundt med en Vibratome med gasset (95% O2, 5% CO2) iskalde aCSF løsning, som inneholder (i mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate og 18 glukose (osmolaritet justert til 300 mOsm). For eksempel hvis målet er å analysere synaptic overføring fra CA3 til CA1 pyramidale nevroner, forberede sagittal skiver av hippocampus dannelse (350 µm tykk).Merk: Dette trinnet og utover fungere under dårlige lysforhold å unngå aktivering av optogenetic sonden av lys i miljøet. La sektorer Gjenopprett i 30 min på 37 ° C i den samme aCSF i et kammer utformet for å holde hjernen skiver. Holde skiver i samme hjernen stykke kammeret ved romtemperatur før opptak.Merk: Bruker disse forholdene, kan skiver vedlikeholdes sunt for opptil 6-8 h. Overføre en skive neddykket opptak kammer og superfuse den med 2 mL/min av den samme aCSF brukes til gjenoppretting med 1,5 mM CaCl2 (totalt Ca2 +: 2,5) og uten NaPyruvate.Merk: Skiver er forberedt og vedlikeholdes i lav konsentrasjon av Ca2 + (1 mM) å minimere toksisitet. Opptak utføres 2,5 Ca2 + å favorisere vesicle utgivelsen. Sjekk kort signal om uttrykt fluorescerende reporteren (f.eks. TdTomato; Figur 3B) å fastslå lokalisering og intensiteten av infeksjon. Fylle en patch elektrode med en intracellulær løsning som inneholder (i mM): 110 K-gluconate, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0,5 Na3-GTP, 20 K2-kreatin fosfat, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 mΩ).Merk: Bruk oppdateringen elektrode med en pipette motstand av 5 – 6 mΩ. Under infrarød belysning, nå tett hele celle konfigurasjon fra en Nevron mottar synaptic innganger fra infiserte neurons. For eksempel hvis CA3 pyramidale nevroner var infisert, patch pyramidale nevroner i den proksimale til mediale skrift i regionen CA1 (Figur 3 c).Merk: Serien motstand kan stå uncompensated, men det bør være konstant og lav (≤20 MΩ). Bruk farmakologi isolere synaptic strøm under etterforskning. For eksempel hvis målet er å undersøke eksitatoriske synaptic overføring, blokkere hemmende synaptic overføring med 10 µM bicuculline. Fremkalle synaptic strøm, for eksempel eksitatoriske postsynaptic strøm (EPSCs), bruke en 473 nm blå laser koplet til en optisk fiber (Ø ≤250 µm) plassert på somata av de infiserte nervecellene (f.eks. CA3 pyramidale nevroner). Justere stimulering lengde til et minimum, for å redusere muligheten for fremkaller flere handling potensial per lys pulsen. Hvis bruker ChETA, sett den til 2 ms15. Justere stimulering styrken på laser til liten, men tydelig synlig synaptic strøm (≤50 pA peak amplitude for EPSCs spilt inn på en holde potensialet i-70 mV mellom CA3 og CA1 pyramidale nevroner; Figur 3D). Hvis bruker ChETA og en optisk fiber på 250 µm i diameter, være stimulering styrkene i 1-3 mW fiber avslutte egnet.Merk: Hvis laser styrke ikke kan reguleres, bruke neutral density filter. Skinne 473 nm laserlys somata av de infiserte nervecellene, men ikke på deres axons. For eksempel skinne lyset på CA3 somata og fra Schaffer materiell, å unngå direkte depolarization av axons. Bruke tetrodotoxin (TTX, 0,5 µM), en blokkering av natrium kanaler, prøve å bekrefte kanalene handling potensial-drevet. I forskjellige innspillinger, bruke en selektiv blokkering i synaptic gjeldende under etterforskning å bekrefte stimulering er selektive.Merk: For eksempel bruke NBQX (10 µM) til AMPA-type glutamat reseptor-mediert EPSCs. Sammenligne optisk og elektrisk vakte synaptic strømmer i samme akutt hjernen stykke svar på gjentatte stimulering (≥2 stimuli ved ≤20 Hz). En tilsvarende grad av synaptic tilrettelegging eller depresjon praktiseres mellom elektriske og optisk stimulering når du bruker en kontroll miR, dermed antyder at lignende cellulære mekanismer aktiveres av de to typene stimulations.Merk: Punktene ovenfor er nødvendig for å sikre at optisk stimulering ikke induserer en direkte depolarization av presynaptic boutons, således omgåelsen noen mekanismer for synaptic overføring. Sammenligne synaptic overføring svar på enkel og repeterende stimulations (≥2 stimuli ved ≤20 Hz) mellom en kontroll miR og miRs rettet mot presynaptic proteiner under etterforskning.