연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

모든 실험 지침 (지침 2010/63/유럽 2014 년 3 월 4 일의), 유럽 공동체 위원회에 의해 설립에 따라 실시 했다 그리고 건강의 이탈리아 정부에 의해 승인 했다. 1. RNA 간섭 및 분리 식 시스템에 그들의 효율성의 평가 위한 microRNAs의 디자인 참고:이 프로토콜 다음 잘 설립 방법의 지식이 필요: 분자 클로닝, DNA 연속, 셀 라인, 칼슘 인산 염 transfection, 양적 실시간 유지 보수 시간 PCR (qRT-PCR), 세포에서 세포 lysates의 준비 그리고 서 부 럽입니다. 관심사의 유전자 대체 접합 적용 되는지 확인 합니다. 유전자의 일반적인 최저 선택 독점적으로 제정 exons; 특정 또는 접합된 isoform의 최저 관련 또는 접합된 exon를 선택 합니다. 전용된 소프트웨어 (예: https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)를 사용 하 여 관심사의 순서에 대 한 RNA 간섭에 대 한 인공 미르 디자인.참고: 그것은 기본적인 현지 줄 맞춤 검색 도구 (폭발)을 사용 하 여 대상에 대 한 가능한 오프-같은 종 내에서 확인 하는 것이 중요. 대상 유전자에 대 한 상위 3 위 미르를 선택 합니다. 적합 한 회사에서 선택한 미르의 위쪽 및 아래쪽 가닥을 주문. 부정적인 제어를 위해 선택 된 미르 나 한 미르는 실험에 사용 되는 종의 알려진된 모든 유전자를 대상으로 하지 예측 한 스크램블된 버전을 사용 (예. 척 추가 있는 유전자, pcDNA6.2-GW/EmGFP-미르-neg에 미르에 대 한). 선택 된 미르의 각각 위쪽 및 아래쪽 가닥 anneal 고 미르 (예: pcDNA6.2-GW/EmGFP-미르) 표준 복제 전략을 사용 하 여의 식을 위한 플라스 미드로 복제.참고: 목표 5′ 미르 측면에 서 지역, 선택한 미르 시퀀스 및 3′ 미르 측면에 서 지역에서는 3′ UTR 취재 원 유전자는 RNA 중 합 효소 유형 II 발기인의 통제의 표현할 수 있는 구성 된 미르 식 카세트를 만드는 것입니다. 연속 DNA를 사용 하 여 선택한 미르의 올바른 삽입을 확인 하기 위해. (37 ° C, 5% CO2) 습도 셀 문화 인큐베이터에서 HEK293 세포 성장 DMEM을 사용 하 여 중간 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) 및 1 x 페니실린/스 (펜/Strep). HEK293 세포 ~ 70% 합칠 때, 미르 식 벡터와 1:1 DNA 비율 칼슘 인산 염 방법6을 사용 하 여 대상된 유전자를 표현 하는 벡터의 각 하를 transfect 공동 다음과 같은 컨트롤이 포함 됩니다: (i) 세포 untransfected, (ii) 세포 어느 캐리어 DNA (예: pBluescript II SK(+)) 또는 (iii) 미르 제어 함께 타겟된 유전자를 표현 하는 벡터와 페.참고: (i) 표현된 타겟된 유전자 해야 있는 쪽으로 미르 디자인 되었다, 동일한 종에서는 미르 대상 시퀀스는 절대적으로 두 종족 사이 뉴클레오티드 수준에서 보존 하지 않으면 합니다. (ii) 셀 라인 HEK293 이외는 사용할 수 있습니다. (transfection, electroporation 또는 liposome 기반 방법 등 iii) 대체 방법은 사용할 수 있습니다. transfection, 후 48 h 세포를 lyse, 단백질 젤 실행, 서쪽 오 점 수행 하 고 콘텐츠 대상 단백질을 인식 하는 항 체와 단백질 분석. 50 %의 최저 효율에 대 한 목표입니다.참고: 때 려 눕 힘 효율성 또는 수 또는 (ii) 해당 하는 경우 대상 단백질의 활동을 측정 하 여 (i) 여 ELISA 분석, 평가, (예: 이온 채널에 대 한 전류 밀도) 또는 (iii) 만약 적합 한 mRNA 수준에서 qRT-PCR 항 체는 사용할 수 없습니다 (프로토콜 단계 3). 문화 요리를 얼음에 놓고 셀 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 한 번 씻어. PBS, 발음 다음 차가운 RIPA 버퍼 (50 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 %NP40, 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 저 해제를 포함, Ø 100 m m, Ø 60 m m의 요리에 대 한 0.5 mL의 요리에 대 한 1 mL)를 추가 합니다. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 접시에 부착 세포를 긁어와 부드럽게 사전 냉각된 microcentrifuge 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 4 ° C에서 15 분 동안 15000 x g에서 튜브 원심, 새로운 사전 냉각된 microcentrifuge 튜브에 상쾌한 전송 및 삭제는 펠 릿. BCA 단백질 분석 실험 키트 또는 다른 적당 한 방법 (예: Bradford 분석 실험)를 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.참고: 샘플 수 수-20 ° C 또는 나중 사용을 위해-80 ° C에서 냉동 하거나 즉시 처리 합니다. 모든 샘플 같은 단백질 농도 같은 볼륨에 있는 모든 lysates 만회 하기 적절 한 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 microcentrifuge 튜브 lysates의 적절 한 볼륨을 전송 합니다.참고: 총 단백질의 30 ~ 50 µ g 단백질의 대부분을 위해 충분 해야 하지만 관심사의 단백질의 풍부에 따라 로드 되도록 적절 한 수량을 결정 한다. 2 x Laemmli 버퍼의 적절 한 금액을 추가 (4 %SDS, 2-mercaptoethanol 10%, 20% 글리세롤, 0.004 %bromophenol 블루, 0.125 M Tris HCl, pH 6.8) 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 끓여 야 하 고. 분자량 표식 함께 아크릴 아 미드 젤에 샘플을 로드 합니다. 100 V 1-2 h에 젤을 실행 합니다.참고: 젤 비율 관심사의 단백질의 크기에 따라 달라 집니다. 전송 샌드위치를 조립 하 고 100 V 2 h 막에 젤에서 단백질을 전송. 니트로 또는 PVDF 막 될 수 있습니다. 1 분에 대 한 메탄올을 가진 PVDF를 활성화 하 고 전송 버퍼와 스택의 준비 하기 전에 그것을 씻어. 블로킹 버퍼를 사용 하 여 실 온에서 1 h 막 차단 (PBST에 5% 우유 (PBS + 0.1% Tween 20)), 다음 4 ° C에서 하룻밤 막 차단 버퍼에 희석 1 차 항 체로 품 어. PBST에 세 번 10 분 막을 세척 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 이차 항 체 HRP 활용으로 품 어. 4 번, PBS에 10 분 동안 막 씻고 막에 chemiluminescent 기판 적용 하 고 CCD 카메라 기반 영상 장치를 사용 하 여 chemiluminescent 신호를 캡처. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 최저 효율 척도를. 두 가장 효율적인 미르 겹치지 시퀀스 추가 기능 분석 실험 대상으로 선택 합니다.참고:-대상 효과 수 있습니다 결코 완전히 배제할 수 어떤 미르에 대 한. 그러나, 두 개의 독립적인 미르 비슷한 효과 있다면, 그것 매우 가능성이 크다이 같은 오프 대상 최저 때문입니다. 선택한 미르의 최저 효율은 만족 스러운 경우 (< 50%), 기타 미르에 대 한 화면. 또는, 익스프레스 연동, 즉 가장 효율적인 miR(s) 익스프레스 그들 최저 효율 증가7에서 발생할 수 있습니다 같은 식 카세트에서 여러 복사본에서. 2. 결합 식의 Optogenetic 프로브 및 microRNAs 재조합 형 Adeno 관련 벡터의 건설 참고:이 프로토콜 다음 잘 설립 방법의 지식이 필요: 분자 클로닝, DNA 시퀀싱 및 rAAV 생산. 각 복제본에는 3′ UTR의 구문 흥분 성의 optogenetic의 표현 및 재조합 rAAVs 생산을 위한 가장 효율적인 미르 식 카세트의 프로브, pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (그림 1A)와 같이 어디에 신경 관련 synapsin 발기인 드라이브 초고속 channelrhodopsin ChETA의 표현, 붉은 형광 기자 TdTomato, 그리고 miR(s) NheI 및 EcoRI 사이트5사이 삽입 합니다.참고: (i) 하지는 ITR (그림 1A, 오렌지) ITR (거꾸로 단말기 반복)에서 길이 약 4.7 Kb rAAVs의 포장 제한을 능가. (ii) 미르 식 카세트 정지 codon WPRE (마 간염 바이러스 Posttranscriptional 규제 요소 사이 삽입 될 필요가 그림 1A)입니다. (형광 단백질, TdTomato, 등을 포함 iii)은 쉽게 지역화와 감염 (프로토콜 단계 4)의 강도 모니터링 수 매우 유용 합니다. 미르 카세트의 올바른 삽입을 연속 DNA를 사용. 생산 및 titer rAAV1/28이전 게시 된 프로토콜 따라, 각 선택 된 미르에 대 한 하나의 rAAV1/2. 1 전형적인 실험 한 유전자의 최저에 대 한 동일한 유전자와 한 미르 컨트롤에 대 한 두 개의 독립적인 미르 포함 됩니다. ≥109 바이러스 성 게놈 (vg)의 바이러스 titer 목표로 / µ L.주의: rAAVs Biosafety 수준 1 (BSL-1) 시설에서 처리 될 필요가 있다. 자세한 내용은 기관 Biosafety 위원회와 확인 하십시오.참고: 실험실에는 바이러스 성 시설 또는 바이러스 titers 만족 하지 않은 경우 rAAV 생산 수 수 아웃소싱. 예를 들어 https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ 또는 https://vcf.charite.de/en/metas/를 방문 하십시오. 3. qRT-PCR에 의해 미르 내 생 유전자의 최저 효율의 평가 대 한 기본 신경 문화에서 RNA 추출 참고: (i)이이 프로토콜 다음 잘 설립 방법의 지식이 필요: 준비 및 기본 신경 문화와 qRT-PCR의 유지 보수. (ii) 최저 효율 (단계 3.1-3.14)의 정량화 적어도 3 회 반복 (생물 복제). (qRT-PCR에 의해 mRNA 수준에서 때 려 눕 힘 효율성의 예측 iii)은 때 어떤 특정 항 체는 사용할 수 있는5isoforms 접합 또는 노크 등 단백질 함량의 분석은 배제 하는 경우에 적합 합니다. 기본 신경 문화 관심 뇌 영역에서 준비 합니다. 대뇌 피 질의 문화 이전 출판9, 다음 수정에 대 한 프로토콜을 따르십시오. 잘 당 500000 뉴런의 밀도에 6 잘 플레이트에서 하는 접시 신경 2.5 mL/잘 첨부 파일 매체와 3.3 mL/유지 보수 매체의 잘 사용 합니다. 사이토 자라 난 관찰 되는 경우 3-4 일에서 생체 외에서 (DIV)에 시 토 신 β-D-arabinofuranoside (1 µ M의 최종 농도)에 대 한의 7.5 µ M와 보완 유지 보수 매체의 0.5 mL/음을 추가 합니다. 5 미르 (기술 복제) 당 3 개의 우물을 감염-6 팀 사용 낮은 감염 복용량 뉴런의 ≥99 %를 감염 됩니다. 각 우물에서 매체의 2 mL을 제거 하 고 50ml 팔 콘 튜브에 수집. 바이러스는 신경 세포에 직접 추가, 부드럽게 혼합 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에 접시를 장소 인큐베이터에서 수집 된 매체를 저장 합니다. 가스 평형 수 있도록 팔 콘 튜브의 캡을 풀어. 24 시간 후에 각 잘 (1.9 mL/잘) 제거 중간 다시를 추가 합니다. 17-18 DIV, RNA 추출에 대 한 신경 세포를 lyse.주의: 세포 시 약 및 클로 프롬 매우 독성이 있다. 화학 후드 작업과 착용 보호 장비; 당신의 국가 및 기관 지침에 따라 폐기물의 처분.참고: 단계 3.3-3.13, RNAse 무료 조건에서 작동 합니다. 장갑을 착용 하 고 유리 RNAse 무료 일회용 plasticware를 사용 하 여. RNA 핸들 하는 방법에 일반적인 조치에 대 한 상담 예 부록 A RNeasy 마이크로 핸드북 사용할 수 온라인. 유리 180 ° c.에 오븐에 하룻밤 파스퇴르 펫을 품 어 번호판 기울기와 발음 완전 하 게 잘 사용 하 여 각 유리 진공 펌프에 연결 된 파스퇴르 피 펫에서 매체. 즉시 각 우물에 세포 시 약의 700 µ L를 추가 합니다. 락을 신중 하 고 간단히 손으로 접시를 흔들어 하 여 솔루션을 균등 하 게 확산. 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 4-5 시간 또는 균질 정지를 얻을 때까지. 별도 1.5 mL Eppendorf 관에 각 우물에서 솔루션을 전송.참고: 셀 lysates-80 ° C에 저장 하거나 즉시 처리 될 수 있습니다. 필요한 경우, 세포 lysates RT에 녹 그리고 3.5 단계로 바로 진행. 각 샘플 세포 lysates의 클로 프롬의 140 µ L를 추가 합니다.참고: 클로 프롬은 휘발성과 어려운 플라스틱, Eppendorf 관을 가능한 한 빨리 닫습니다. 15에 대 한 적극적으로 Eppendorf 관을 흔들어 s 또는 샘플은 유화 완전히 될 때까지. 1-2 분 동안 또는 액체 단계 분리를 시작 때까지 RT에서 샘플을 유지. 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 위 수성 단계 (~ 320 µ L) 새로운 Eppendorf 관에 RNA를 포함 된 전송 및 남은 액체를 삭제.참고: 낮은 핑크 유기 단계 또는 백색 반지는 피 펫의 끝을 가진 두 단계 사이 만지지 마십시오. 수성 단계 100% 에탄올 (480 µ L)의 1.5 볼륨을 추가 하 고 혼합 3 번 위아래로 천천히 솔루션 플라스틱. 작은 샘플에서 RNA의 정화를 위한 상용 키트를 사용 하 여 RNA를 정화. 분 광 광도 계와 RNA 농도 및 샘플 순도 계량.참고: (i) 기대 수익률의 ≥3.5 µ g /; 260/280와 260/230 비율 단백질 및 유기 화합물의 순도 한다 둘 다에 대 한 ≥1.9. (ii) RNA 샘플-80 ° C에 저장 하거나 즉시 처리 될 수 있습니다. RNA의 Retrotranscribe 250, 500 또는 1000 ng 상용 키트와 함께 QRT-PCR에 의해 관심의 내 생 유전자에 대 한 최저 효율을 계량. 자세한 프로토콜에 대 한 참조10을 참조 하십시오. ≥60% (그림 2)의 최저 효율을 목표로 합니다. ≥2 내부 관리 유전자 (예데이터 표준화. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) 사용 하는 여러 유전자 내부 제어 방법11.참고: 쥐에서 작업 하는 경우 내부 관리 유전자에 대 한 다음 PCR 뇌관 사용: GAPDH fwd: 5′ 3′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 및 GAPDH 계: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′; ACTB-fwd: 5′ 3′ CATCACTATCGGCAATGAGC 및 ACTB 계: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′; TUBB3-fwd: 5′ 3′ GCCTTTGGACACCTATTCAG 및 TUBB3 계: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′; PPIA-fwd: 5 ‘ 3′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 및 PPIA 계 5′ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3’. 4. 평가 Optogenetics와 노크 다운 신경의 표적된 자극에 의해 그대로 신경 회로에 연 접 단백질의 역할 참고: 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 급성 뇌 조각과 electrophysiological 설치에 대 한 액세스에 이전 경험을 요구 한다. Stereotactically 이전 게시12자세한 프로토콜에 따라 두뇌에 rAAV1/2 주사. 정위 적 지도 사용 하 여 마우스13 또는 쥐 뇌14에 대 한 관심의 뇌 영역에 대 한 정위 적 좌표를 결정 합니다. 7-9 µ m; Ø의 긴 정강이로 주입 micropipettes를 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 가 위 정강이에 주입 micropipettes를 클립. 얇은 마커 및 그래프 용지를 사용 하 여 주입 micropipettes 모든 2mm에 보정 표를. Anesthetize와 isoflurane 동물 하 고 정위 적 장치에 그것을 해결. 37 ° c.에 설정 하는 생리대는 작업을 통해 따뜻한 동물 유지 눈 윤활제와 눈을 보호 합니다. 전기 면도기로 머리에 모피를 면도. 목화 꽃 봉 오리를 사용 하 여 면도 머리에 povidone 요오드 확산. 해 현미경 중간 절 개를 확인 합니다. 그래서 bregma 및 람다 표시 되도록 면봉으로 두개골 표면 청소. 그것의 소유자에 주입 micropipette를 놓습니다. 정위 적 팔에 홀더를 연결 합니다. 결정 하는 x 및 y 좌표는 bregma 또는 람다 기준으로 사출 사이트의. 드릴을 사용 하 여 대상 영역 두개골 얇은.참고: 부드러운 원형 움직임을 사용 하 고이 두뇌의 표면에 손상을 것입니다 두개골을 드릴 하지 마십시오. 거기는 출혈 하는 경우 흡수 수건 종이와 과도 한 혈액.참고: 과도 한 혈액이 하게된다 그것은 z 좌표를 제대로 확인 하기 어렵습니다. 모 세관 작용에 의해 바이러스의 ≤2 µ L 주입 micropipette 로드. X 및 y를 주입 micropipette가지고 주입의 사이트의 좌표. 경질에서 z 좌표를 계산 하 고 뇌에 피펫으로 천천히 낮은. Z 좌표에 도달 하면 조직의 조정 수 있도록 3 분을 기다립니다. 1 mL 주사기 주입 micropipette의 뒷면에 있는 유연한 튜브를 통해 연결을 사용 하 여 낮은 긍정적인 압력을 적용 합니다. 시각적으로 해 부 현미경을 통해 주입 micropipette에서 바이러스의 방출의 속도 모니터링 하 고 참조 점으로 표시는 보정을 사용 하 여.참고: 바이러스는 느린 속도로 주입 해야 (< 100 nL/min) 조직 손상을 방지 하기 위해. 주입이 끝나면 5 분을 기다려, 0.2 m m에 의해 주입 micropipette 철회, 바이러스의 역류를 방지 하려면 또 다른 5 분 기다립니다. 사출 micropipette 천천히 그리고 완전히에서 철수는 두뇌 및 그것의 dispose 컨테이너 표 백제로 가득에. 생리 적인 솔루션으로 두개골을 습식 및 3-4 바늘으로 피부를 봉합. 상처에 gentamicin 연 고를 적용 합니다. 단일 집 음식과 깨끗 한 장에 동물 쥐 똥 고 그것까지 열 램프 아래에서 완벽 하 게 복구. ≥15 일 후 주입, 목을 벨 깊은 isoflurane 마 취 동물. Vibratome 사용 하 여 기름 (95% O2, 5% CO2)의 뇌 영역의 급성 뇌 조각 준비 (mM)에 포함 된 차가운 실제 솔루션: 123 NaCl, 1.25 KCl, 1.25 KH2포4, 1.5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate와 18 포도 (osmolarity 300 mOsm 조정). 예를 들어 목표 CA1 피라미드 뉴런 CA3에서 시 냅 스 전송 분석 하는 것입니다, 화살 조각의 hippocampal 형성 (350 µ m 두께)을 준비 합니다.참고:이 단계 이후부터 환경 빛 optogenetic 조사의 활성화를 피하기 위해 낮은 조명 조건 하에서 작동 합니다. 조각을 들고 뇌 조각을 위한 챔버에 같은 실제에서 37 ° C에서 30 분 동안 복구 하자. 녹음까지 실내 온도에 동일한 뇌 조각 챔버에 슬라이스를 유지.참고: 이러한 조건을 사용 하 여, 조각은 유지할 수 있습니다 최대 6-8 h에 대 한 건강 한. 하나는 전송 그것을 슬라이스 침수 녹음 실과 superfuse에 1.5 m m CaCl2 보충 하는 복구에 사용 되는 같은 실제의 2 mL/min (Ca2 +총: 2.5 m m) NaPyruvate 없이.참고: 조각 준비 하 고 캘리포니아의2 + (1 mM) 독성을 최소화 하기 위해 낮은 농도에서 유지 됩니다. 녹음은 2.5 m m Ca2 + 기 릴리스를 수행 됩니다. 짧게 표현한 형광 기자 (예신호 확인. TdTomato; 그림 3B) 에 현지화 및 감염의 강도 확인 합니다. (MM)에 포함 하는 세포내 솔루션 패치 전극 채우기: 110 K-구 루 콘, 22 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0.5 나, 0.5 EGTA, 5 NaCl, KCl3-GTP, 20 K2-크 레 아 틴 인산 염, 10 HEPES-코 (pH 7.28, 290 m ω).참고: 5-6 m ω의 저항을 피 펫을 패치 전극을 사용 합니다. 적외선 조명 아래 단단한 물개 전체 셀 구성에서 감염 된 신경에서 시 냅 시스 입력을 받는 신경에 도달. 예를 들어 CA3 피라미드 뉴런 감염 된 경우 (그림 3C) CA1 영역의 중간 지 대에 인접에 피라미드 뉴런 패치.참고: 직렬 저항 남아 있을 수 있는 교수진, 하지만 상수 및 낮은 (≤20 m ω) 이어야 한다. 약리학을 사용 하 여 조사 시 냅 스 전류를 분리. 예를 들어 목표는 흥분 성의 시 냅 스 전송을 조사 하는, 10 µ M bicuculline 억제 시 냅 스 전송을 차단 합니다. 예를 들어 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs), 광섬유 (Ø ≤250 µ m)에 (예감염 된 신경 somata를 결합 473 nm 청색 레이저를 사용 하 여 시 냅 스 전류를 일 깨우 다. CA3 피라미드 뉴런)입니다. 자극을 evoking 빛 펄스 당 하나 이상의 행동 잠재력의 가능성을 줄이기 위해 최소 길이 조정 합니다. ChETA를 사용 하 여, 2 ms15설정. 작지만 명확 하 게 감지 시 냅 스 전류를 레이저의 자극 강도 조정 (≤50 pA 피크 진폭 EPSCs-70의 지주 잠재력에 기록 CA3 CA1 피라미드 뉴런; 사이 mV 그림 3D)입니다. 직경에 있는 ChETA와 250 μ m의 광섬유를 사용 하 여, 자극 섬유에서 1-3 mW의 힘 종료 적합 해야 합니다.참고: 중립 밀도 필터를 사용 하는 레이저 강도 조정할 수 없습니다, 경우. 감염 된 신경 somata 하지만 그들의 축 삭에 473 nm 레이저 빛을 빛나게. 예를 들어 빛는 CA3 somata, 그리고 축 삭의 직접 도발은 피하려고 Schaffer 민간인에서. 테트로도톡신 (TTX; 0.5 µ M)를 적용, 나트륨 수로, 채널을 확인 하는 샘플의 차단기는 활동 전위 기반. 다른 기록에서 선택적 자극을 확인 하기 위해 조사 시 냅 스 전류를 선택적 차단제를 적용 합니다.참고: 예를 들어 NBQX을 적용 (10 µ M)에 AMPA 형 조미료 수용 체-중재 EPSCs. 반복적인 자극 (≤20 Hz에서 ≥2 자극)에 대 한 응답 같은 급성 뇌 조각에 갖는 광학 및 전기 시 냅 스 전류를 비교 합니다. 시 냅 스 촉진 이나 우울증 비슷한 정도의 제어 미르, 따라서 제안 유사한 세포 메커니즘 stimulations의 두 종류에 의해 활성화 됩니다를 사용 하 여 전기 및 광학 자극 사이 관찰 해야.참고: 위의 단계는 광 자극 연 접 boutons, 따라서 시 냅 시스 전송의 일부 메커니즘을 우회의 직접 도발은 유도 하지 않습니다 보장 하기 위해 필요 합니다. 시 냅 스 전송 제어 미르와 미르 대상으로 조사를 받고 연 접 단백질 사이의 단일 및 반복 stimulations (≤20 Hz에서 ≥2 자극)에 대 한 응답을 비교 합니다.