कृत्रिम microRNAs के साथ Optogenetics का मेल करने के लिए बरकरार न्यूरॉन सर्किट के भीतर Presynaptic समारोह पर जीन पछाड़ना के प्रभाव की विशेषता
Summary
इस प्रोटोकॉल कैसे optogenetics के साथ कृत्रिम microRNA-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप गठबंधन करने के लिए पर एक कार्यप्रवाह प्रदान करता है विशेष रूप से चयनात्मक जीन की कम अभिव्यक्ति के साथ presynaptic बूटोंस को उत्तेजित करने के लिए (s) बरकरार न्यूरॉन सर्किट के भीतर.
Abstract
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बरकरार न्यूरॉन सर्किट के भीतर presynaptic समारोह पर जीन पछाड़ना के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए है. हम कैसे कृत्रिम microRNA (मीर) गठबंधन करने पर एक कार्यप्रवाह का वर्णन-optogenetics तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में हेरफेर presynaptic बूटोंस के चयनात्मक उत्तेजना प्राप्त करने के लिए के साथ मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक वायरल का निर्माण और एक भी न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटर दोनों एक optogenetic जांच और कृत्रिम मीर (एस) presynaptic जीन (एस) के खिलाफ की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपयोग शामिल है । जब stereotactically ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र में इंजेक्शन, व्यक्त की निर्माण यह प्रकाश के साथ विशेष रूप से ंयूरॉंस की जांच के तहत जीन (एस) की कम अभिव्यक्ति के साथ उत्तेजित करने के लिए संभव बनाता है । इस रणनीति के विकास और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के रखरखाव की आवश्यकता नहीं है और सिद्धांत रूप में कर सकते है अंय जीवों के लिए लागू किया जा सकता है और किसी की पसंद के ंयूरॉंस जीन । हमने हाल ही में यह जांच करने के लिए आवेदन किया है कि presynaptic P/Q-type वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल (VGCCs) के वैकल्पिक ब्याह के isoforms की पछाड़ना तीव्र synaptic स्लाइस में CA3 CA1 उत्तेजक करने के लिए synapses में अल्पकालिक हिप्पोकैम्पस प्लास्टिक को नियंत्रित करता है । इसी तरह के एक दृष्टिकोण भी vivo मेंन्यूरॉन सर्किट की हेरफेर और जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नया दृष्टिकोण को बरकरार न्यूरॉन सर्किट के भीतर presynaptic समारोह पर जीन पछाड़ना के प्रभाव को चिह्नित करता है । बरकरार न्यूरॉन सर्किट में presynaptic समारोह की जाँच चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कई presynaptic बूटोंस बहुत छोटे हैं और सोमा से दूर करने के लिए संयुक्त आणविक और electrophysiological हस्तक्षेप की अनुमति है. हालांकि आरएनए हस्तक्षेप पछाड़ना synaptic प्रोटीन के लिए एक शक्तिशाली और लचीला साधन प्रदान करता है1, इस दृष्टिकोण presynaptic समारोह की जांच करने के लिए किफ़ायत से इस्तेमाल किया गया है क्योंकि यह पारंपरिक का उपयोग पछाड़ना के प्रभाव का पता लगाने के लिए मुश्किल है विद्युत उत्तेजना, जो हेर और भोली के बीच भेद नहीं presynaptic बूटोंस2। यहाँ, हम का वर्णन कैसे कृत्रिम microRNA (मीर) गठबंधन करने के लिए-हाल ही में विकसित optogenetic प्रौद्योगिकी तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में हेरफेर presynaptic बूटोंस के चयनात्मक उत्तेजना को प्राप्त करने के साथ मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप.
जबकि सशर्त नॉकआउट चूहों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ संयोजन में भी presynaptic प्रोटीन के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है3,4, हमारी रणनीति के विकास और आनुवंशिक रूप से रखरखाव की आवश्यकता नहीं है संशोधित माउस लाइनों और भी आसानी से नीचे एक जीन के विशिष्ट isoforms दस्तक कार्यरत हो सकते हैं । अधिक सामांयतः प्रयुक्त लघु hairpin RNAs (shRNAs) के सापेक्ष, कृत्रिम miRs, जो हम यहां रोजगार, ंयूरॉंस में पछाड़ना के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं । shRNAs के विपरीत, वे एक पोलीमरेज़ द्वितीय प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त किया जा सकता है1। इस प्रकार, एक प्रमोटर दोनों मीर और एक optogenetic जांच की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ । इस तरह, निर्माण के आकार रिकॉमबिनेंट adeno के पैकेजिंग सीमा के भीतर रखा जा सकता है-जुड़े वायरस (rAAV, चित्र 1a) । इसके अलावा, एक एकल निर्माण और एक प्रमोटर के उपयोग प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता कम कर देता है क्योंकि यह मीर, optogenetic जांच और एक निश्चित अनुपात में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देती है ।
हमने हाल ही में इस तकनीक को लागू किया है हिप्पोकैम्पस5में presynaptic कैल्शियम चैनलों के वैकल्पिक रूप से ब्याह isoforms की भूमिका की जांच करने के लिए । इस तरह की एक रणनीति आम तौर पर अंय presynaptically की शारीरिक प्रासंगिकता का अध्ययन करने के लिए लागू होता है ब्याज की किसी भी मस्तिष्क सर्किट में प्रोटीन व्यक्त की ।
Protocol
सभी प्रयोगों यूरोपीय समुदाय परिषद द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था (2010/63/यूरोपीय संघ के 4 मार्च 2014 के), और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया । 1. आरएनए हस्तक्षेप और Heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में उनकी दक्षता के मूल्यांकन के लिए microRNAs की डिजाइन नोट: इस प्रोटोकॉल निंनलिखित अच्छी तरह से स्थापित तरीकों के ज्ञान की आवश्यकता है: आणविक क्लोनिंग, डीएनए अनुक्रमण, सेल लाइनों के रखरखाव, कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर), सेल लाइनों से सेल lysates की तैयारी और वेस्टर्न सोख्ता । पता लगाएं कि ब्याज का जीन वैकल्पिक ब्याह के अधीन है या नहीं. जीन की एक सामांय पछाड़ना के लिए, विशेष रूप से गठित exons का चयन करें; एक विशिष्ट वैकल्पिक ब्याह isoform के एक पछाड़ना के लिए, प्रासंगिक वैकल्पिक ब्याह एक्सॉन का चयन करें । समर्पित सॉफ्टवेयर (उदा https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) का उपयोग करने के लिए ब्याज के अनुक्रम के खिलाफ आरएनए हस्तक्षेप के लिए कृत्रिम miRs डिजाइन ।नोट: यह एक बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) एक ही प्रजाति के भीतर संभव बंद लक्ष्य के लिए जांच करने के लिए उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । लक्ष्य जीन के लिए शीर्ष तीन स्थान miRs का चयन करें । एक उपयुक्त कंपनी से चयनित miRs के ऊपर और नीचे किस्में आदेश । नकारात्मक नियंत्रण के लिए, एक चयनित miRs या एक मीर के एक तले हुए संस्करण का उपयोग प्रयोग में प्रयुक्त प्रजातियों में से किसी भी ज्ञात जीन को लक्षित नहीं की भविष्यवाणी की (उदाहड्डीवाला जीन के लिए, pcdna 6.2 गिनीकृमि में मौजूद मीर/EmGFP-मीर-नेग) । चयनित miRs के संबंधित ऊपर और नीचे किस्में एनएन और उंहें एक miRs की अभिव्यक्ति के लिए डिजाइन प्लाज्मिड में क्लोन (जैसे कि pcdna 6.2-गिनीकृमि/EmGFP-मीर) मानक क्लोनिंग रणनीतियों का उपयोग कर ।नोट: उद्देश्य एक मीर अभिव्यक्ति एक 5 ‘ मीर पार्श्व क्षेत्र से मिलकर कैसेट बनाने के लिए है, चयनित मीर अनुक्रम और एक 3 ‘ मीर पार्श्व क्षेत्र है कि 3 ‘ एक आरएनए पोलीमरेज़ प्रकार द्वितीय प्रमोटर के नियंत्रण में एक रिपोर्टर जीन के UTR से व्यक्त किया जा सकता है । चयनित miRs की सही प्रविष्टि को मान्य करने के लिए डीएनए sequencing का उपयोग करें । एक humidified सेल संस्कृति मशीन में HEK293 कोशिकाओं को विकसित (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सह2) DMEM मध्यम के साथ पूरक का उपयोग कर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 मिमी NaPyruvate, 10 मिमी HEPES (पीएच ७.३९) और 1x पेनिसिलिन/streptomycin (पेन/Strep) । जब HEK293 कोशिकाओं रहे है ~ 70% धाराप्रवाह, सह उंहें मीर अभिव्यक्ति वैक्टर और एक सदिश एक 1:1 डीएनए अनुपात में एक लक्षित जीन व्यक्त करने के साथ transfect कैल्शियम फॉस्फेट विधि6का उपयोग कर । निंनलिखित नियंत्रण शामिल हैं: (i) untransfected कोशिकाओं, (ii) सदिश के साथ transfected कोशिकाओं को लक्षित जीन या तो वाहक डीएनए के साथ एक साथ व्यक्त (उदा pBluescript ii SK (+)) या (iii) मीर नियंत्रण ।नोट: (i) व्यक्त लक्षित जीन एक ही प्रजाति है जो की ओर से miRs डिजाइन किए गए थे, जब तक miRs द्वारा लक्षित अनुक्रम बिल्कुल दो प्रजातियों के बीच न्यूक्लियोटाइड स्तर पर संरक्षित कर रहे है से होना चाहिए । (ii) HEK293 के अलावा अंय कक्ष रेखाओं का उपयोग किया जा सकता है । (iii) अभिकर्मक के वैकल्पिक तरीकों, जैसे electroporation या liposome-आधारित विधियों का उपयोग किया जा सकता है । 48 एच अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं लाइसे, प्रोटीन जेल चलाने के लिए, पश्चिमी दाग प्रदर्शन और एक एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन पहचानने के साथ प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण । ≥ 50% की एक पछाड़ना क्षमता के लिए निशाना लगाओ ।नोट: पछाड़ना दक्षता वैकल्पिक रूप से कर सकते हैं, या इसके अलावा, (i) एलिसा विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, (द्वितीय) लक्ष्य प्रोटीन की गतिविधि को मापने के द्वारा अगर लागू (आयन चैनलों के लिए वर्तमान घनत्व) या (iii) द्वारा qRT-mRNA स्तर पर पीसीआर अगर उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं (प्रोटोकॉल चरण 3). बर्फ पर संस्कृति बर्तन प्लेस और बर्फ ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने । पंजाबियों को महाप्राण, फिर जोड़ें आइस-कोल्ड RIPA बफर (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 एमएम NaCl, 2 एमएम EDTA, 1% NP40, 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस), जिसमें चिढ़ाना और फॉस्फेट अवरोधकों; ø 100 मिमी के पकवान के लिए 1 मिलीलीटर, ø 60 मिमी की एक डिश के लिए 0.5 मिलीलीटर) । एक सेल खुरचनी का उपयोग कर पकवान बंद अनुयाई कोशिकाओं परिमार्जन और धीरे एक पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x जी में ट्यूब केंद्रापसारक, एक नए पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और गोली त्यागें । निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर बीसीए प्रोटीन परख किट या अंय उपयुक्त विधि (ब्रैडफोर्ड परखउदाहरण के लिए) ।नोट: नमूने या तो पर जमे हुए किया जा सकता है-20 ° c या-80 ° c बाद में उपयोग के लिए, या तुरंत संसाधित । microcentrifuge ट्यूबों के लिए lysates का एक उचित मात्रा स्थानांतरण इतना है कि सभी नमूनों एक ही प्रोटीन एकाग्रता है और एक ही मात्रा के लिए सभी lysates बनाने के लिए पर्याप्त बर्फ ठंडा lysis बफर जोड़ें ।नोट: कुल प्रोटीन के 30 से 50 µ g प्रोटीन के अधिकांश के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन उचित मात्रा में लोड किया जाना चाहिए ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए । 2x Laemmli बफर की एक उचित मात्रा में जोड़ें (4% एसडीएस, 10% 2-mercaptoethanol, 20% ग्लिसरॉल, ०.००४% bromophenol ब्लू, ०.१२५ एम Tris-एचसीएल, पीएच 6.8) और 5 मिनट के लिए 95 ° c पर नमूने फोड़ा । एक आणविक वजन मार्कर के साथ साथ एक acrylamide जेल पर नमूने लोड । 100 वी 1-2 एच के लिए पर जेल चलाते हैं ।नोट: जेल प्रतिशत ब्याज के प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है । स्थानांतरण सैंडविच इकट्ठा और जेल से प्रोटीन पर एक झिल्ली पर स्थानांतरण 100 V 2 एच के लिए । झिल्ली या तो nitrocellulose या PVDF हो सकता है । PVDF मेथनॉल के साथ 1 मिनट के लिए सक्रिय करें और स्टैक तैयार करने से पहले इसे स्थानांतरण बफ़र के साथ कुल्ला । ब्लॉक बफर का उपयोग करते हुए कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए झिल्ली को अवरुद्ध (PBST (पंजाब + 0.1% के बीच-20)) में 5% दूध, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली की प्राथमिक एंटीबॉडी बफर अवरुद्ध में पतला के साथ । तीन बार PBST में 10 मिनट के लिए झिल्ली धोने और कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए बफर अवरुद्ध में एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ यह मशीन । पंजाब में 10 मिनट के लिए झिल्ली धो चार बार, तो झिल्ली को chemiluminescent सब्सट्रेट लागू करते हैं और एक सीसीडी कैमरा आधारित imager का उपयोग कर chemiluminescent संकेतों पर कब्जा. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए पछाड़ना क्षमता मात्रा । दो सबसे कुशल miRs आगे कार्यात्मक परख के लिए गैर अतिव्यापी दृश्यों लक्ष्यीकरण का चयन करें ।नोट: ऑफ लक्ष्य प्रभाव कभी नहीं पूरी तरह से किसी भी मीर के लिए शासन कर सकते हैं । हालांकि, अगर दो स्वतंत्र miRs एक समान प्रभाव है, यह बेहद संभावना नहीं है कि यह एक ही बंद लक्ष्य पछाड़ना की वजह से है । यदि चयनित miRs की पछाड़ना दक्षता संतोषजनक नहीं है (< 50%), तो अंय miRs के लिए स्क्रीन । वैकल्पिक रूप से, मिलकर सबसे कुशल मीर (ओं) को व्यक्त, अर्थात् उंहें एक ही अभिव्यक्ति कैसेट, जो वृद्धि हुई पछाड़ना दक्षता7में परिणाम हो सकता है से एकाधिक प्रतियां में व्यक्त करते हैं । 2. Optogenetic जांच और microRNAs की संयुक्त अभिव्यक्ति के लिए रिकॉमबिनेंट Adeno-संबद्ध वैक्टर का निर्माण नोट: इस प्रोटोकॉल निंनलिखित अच्छी तरह से स्थापित तरीकों के ज्ञान की आवश्यकता है: आणविक क्लोनिंग, डीएनए अनुक्रमण और rAAV उत्पादन । रिकॉमबिनेंट rAAVs और उत्तेजक optogenetic जांच की अभिव्यक्ति के उत्पादन के लिए डिजाइन के निर्माण के 3 ‘ UTR में सबसे कुशल मीर अभिव्यक्ति कैसेट के प्रत्येक क्लोन, जैसे pAAV में Syn-ChETA-TdT-मीर-एक्स (आंकड़ा 1a), जहां ंयूरॉन-विशिष्ट synapsin प्रवर्तक ultrafast channelrhodopsin ChETA, रेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर TdTomato, और मीर (एस की अभिव्यक्ति ड्राइव) NheI और EcoRI साइटों के बीच डाला5।नोट: (i) rAAVs की पैकेजिंग सीमा को पार न करें, जो आईटीआर (औंधा टर्मिनल दोहराव) से आईटीआर की लंबाई में लगभग 4.7 Kb है (चित्र 1a, नारंगी). (२) मीर अभिव्यक्ति कैसेट को स्टॉप codon और WPRE (Woodchuck हेपेटाइटिस वायरस Posttranscriptional विनियामक तत्व के बीच सम्मिलित किए जाने की आवश्यकता है; चित्र 1a) । (iii) TdTomato के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन का समावेश, अत्यंत के रूप में यह आसानी से स्थानीयकरण और संक्रमण की तीव्रता (प्रोटोकॉल चरण 4) की निगरानी के लिए अनुमति देता है उपयोगी है । मीर कैसेट्स की सही प्रविष्टि को मान्य करने के लिए डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करें । उत्पादन और titer rAAV1/2 पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार8, प्रत्येक चयनित मीर के लिए एक rAAV1/ एक जीन के पछाड़ना के लिए एक ठेठ प्रयोग एक ही जीन और एक मीर नियंत्रण के खिलाफ दो स्वतंत्र miRs शामिल होंगे । ≥ 109 वायरल जीनोम (वी. आर.)/µ एल के एक वायरस titer के लिए निशाना लगाओसावधानी: rAAVs को एक सुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल-1) सुविधा में नियंत्रित किया जाना चाहिए । विस्तृत जानकारी के लिए संस्थागत सुरक्षा समिति के साथ जांच करें ।नोट: अगर लेबोरेटरी में वायरल की सुविधा नहीं है या फिर वायरल titers संतोषजनक नहीं हैं तो rAAV प्रोडक्शन को आउटसोर्स किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/या https://vcf.charite.de/en/metas/पर जाएं । 3. qRT द्वारा अंतर्जात जीन के मीर पछाड़ना दक्षता के मूल्यांकन के लिए प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृतियों से आरएनए का निष्कर्षण-पीसीआर नोट: (i) इस प्रोटोकॉल निंनलिखित अच्छी तरह से स्थापित तरीकों के ज्ञान की आवश्यकता है: तैयारी और प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृतियों और qRT-पीसीआर के रखरखाव । (ii) पछाड़ना दक्षता के ठहराव को दोहराएं (कदम 3.1 – 3) से कम (जैविक प्रतिकृति) । (iii) qRT-पीसीआर द्वारा mRNA स्तर पर पछाड़ना दक्षता का आकलन उपयुक्त है जब प्रोटीन सामग्री का एक विश्लेषण precluded है, जैसे जब नीचे दस्तक वैकल्पिक रूप से ब्याह isoforms जिसके लिए विशिष्ट एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं5. ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र से प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृतियों तैयार करते हैं । पिछले प्रकाशन में दी गई cortical संस्कृतियों के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें9, निंन संशोधनों के साथ: अच्छी तरह से प्रति 500,000 न्यूरॉन्स के घनत्व पर प्लेट न्यूरॉन्स में 6 अच्छी तरह से प्लेटें. अटैचमेंट मीडियम के 2.5 एमएल/कुआं का प्रयोग करें और रखरखाव माध्यम के 3.3 मिलीलीटर/ यदि astrocyte अधिक वृद्धि मनाया जाता है, रखरखाव माध्यम के 0.5 मिलीलीटर/cytosine β-D-arabinofuranoside के 7.5 µ m के साथ पूरक (1 µ m की अंतिम एकाग्रता के लिए) में 3-4 दिन इन विट्रो (DIV) में जोड़ें । मीर प्रति तीन कुओं संक्रमित (तकनीकी प्रतिकृति) पर 5–6 DIV. सबसे कम संक्रामक खुराक जो न्यूरॉन्स के ≥ 99% संक्रमित होगा का उपयोग करें । एक अच्छी तरह से मध्यम के 2 मिलीलीटर निकालें और यह एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में इकट्ठा । सीधे न्यूरॉन्स के लिए वायरस जोड़ें, धीरे मिश्रण और प्लेटें वापस मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर जगह. मशीन में एकत्र माध्यम स्टोर । बाज़ ट्यूब की टोपी ढीला करने के लिए गैस equilibration अनुमति देते हैं । 24 घंटे के बाद, एक अच्छी तरह से हटाया मध्यम वापस जोड़ें (1.9 मिलीलीटर/ 17–18 DIV, आरएनए निष्कर्षण के लिए न्यूरॉन्स लाइसे ।सावधानी: Lysis रिएजेंट और क्लोरोफॉर्म बेहद जहरीले होते हैं । एक रासायनिक डाकू के तहत काम करते हैं और सुरक्षात्मक गियर पहनते हैं; अपने राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार अपशिष्ट का निपटान ।नोट: कदम 3.3 – 3.13 के लिए, RNAse-free शर्तों में काम करते हैं । दस्ताने पहनें और RNAse-मुक्त कांच के और प्रयोज्य plasticware का उपयोग करें । कैसे आरएनए संभाल करने के लिए पर सामान्य सावधानियों के लिए, उदाहरण के लिए परिशिष्ट एक RNeasy माइक्रो पुस्तिका ऑनलाइन उपलब्ध की सलाह. एक ओवन में 180 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गिलास पाश्चर पिपेट । प्लेटों झुकाव और एक अच्छी तरह से एक वैक्यूम पंप से जुड़े एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर के माध्यम से महाप्राण पूरी तरह से मध्यम । तुरंत एक अच्छी तरह से Lysis रिएजेंट के 700 µ एल जोड़ें । कंपन और हाथ से प्लेट ध्यान से और संक्षेप में मिलाते हुए समान रूप से समाधान फैलाओ । समाधान पिपेट ऊपर और नीचे 4-5 बार या जब तक एक सजातीय निलंबन प्राप्त की है । प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में से समाधान हस्तांतरण ।नोट: सेल lysates-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत संसाधित । यदि आवश्यक हो, तो आरटी पर lysates सेल, और 3.5 कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना । सेल lysates के प्रत्येक नमूने के लिए क्लोरोफॉर्म के 140 µ l को जोड़ें ।नोट: क्लोरोफॉर्म अस्थिर और पिपेट के लिए मुश्किल है, जितनी जल्दी हो सके Eppendorf ट्यूबों को बंद करें । 15 एस के लिए जोरदार Eppendorf ट्यूबों शेक या जब तक नमूने पूरी तरह से emulsified हैं । 1 के लिए आरटी पर नमूना रखें-2 मिनट या जब तक तरल चरणों के लिए अलग शुरू करते हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x जी में नमूने केंद्रापसारक । एक नई Eppendorf ट्यूब करने के लिए आरएनए युक्त ऊपरी जलीय चरण (~ 320 µ एल) स्थानांतरण, और शेष तरल त्यागें ।नोट: कम गुलाबी कार्बनिक चरण या पिपेट की नोक के साथ दो चरणों के बीच सफेद अंगूठी स्पर्श न करें । 100% इथेनॉल के 1.5 मात्रा में जोड़ें (480 µ एल) जलीय चरण के लिए, और पिपेट समाधान धीरे ऊपर और नीचे 3 बार मिश्रण करने के लिए । छोटे नमूनों से आरएनए के शुद्धिकरण के लिए डिज़ाइन किए गए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर आरएनए को शुद्ध करना । एक spectrophotometer के साथ आरएनए एकाग्रता और नमूना शुद्धता को बढ़ाता है ।नोट: (i) ≥ की पैदावार की अपेक्षा 3.5 µ g/ प्रोटीन और कार्बनिक यौगिकों पर शुद्धता के लिए 260/280 और 260/230 अनुपात दोनों ≥ 1.9 होना चाहिए । (ii) आरएनए नमूने-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत संसाधित । Retrotranscribe 250, 500 या 1000 आरएनए के एनजी एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ । qRT-पीसीआर द्वारा ब्याज की अंतर्जात जीन के लिए पछाड़ना क्षमता को बढ़ाता है । विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए,10संदर्भ देखें । ≥ 60% (चित्रा 2) की एक पछाड़ना दक्षता के लिए निशाना लगाओ । 2 गृह व्यवस्था जीन ≥ करने के लिए डेटा को सामान्य (उदा GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) एकाधिक आंतरिक नियंत्रण जीन विधि11का उपयोग करना ।नोट: अगर चूहे में काम कर, गृह व्यवस्था जीन के लिए निंनलिखित पीसीआर प्राइमरों का उपयोग करें: GAPDH-fwd: 5 ‘ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3 ‘ और GAPDH-rev: 5 ‘ GATGATGACCCTTTTGGC 3 ‘; ACTB-fwd: 5 ‘ CATCACTATCGGCAATGAGC 3 ‘ और ACTB-rev: 5 ‘ TCATGGATGCCACAGGATT 3 ‘; TUBB3-fwd: 5 ‘ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3 ‘ और TUBB3-rev: 5 ‘ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3 ‘; PPIA-fwd: 5 ‘ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3 ‘ और PPIA-rev 5 ‘ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3 ‘ । 4. Optogenetics के साथ खटखटाया-नीचे न्यूरॉन्स के लक्षित उत्तेजना द्वारा बरकरार न्यूरॉन सर्किट में Presynaptic प्रोटीन की भूमिका का आकलन नोट: निम्न प्रोटोकॉल तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में electrophysiological रिकॉर्डिंग और एक electrophysiological सेटअप करने के लिए उपयोग के साथ पिछले अनुभव की आवश्यकता है. Stereotactically पिछले प्रकाशन12में एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद मस्तिष्क में rAAV1/ स्टीरियोटैक्टिक माउस के लिए स्टीरियोटैक्टिक atlases का उपयोग कर ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के लिए निर्देशांक का निर्धारण13 या चूहे मस्तिष्क14. Ø 7-9 µm की लंबी टांगों के साथ इंजेक्शन micropipettes खींचने के लिए एक micropipette खींचने का प्रयोग करें; क्लिप कैंची के साथ टांगों पर इंजेक्शन micropipettes । इंजेक्शन micropipettes हर 2 मिमी पर निशान लगाने की जगह के लिए एक पतली मार्कर और ग्राफ कागज का प्रयोग करें । isoflurane के साथ पशु Anesthetize और यह स्टीरियोटैक्टिक उपकरण में ठीक । 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग पैड के साथ आपरेशन के दौरान पशु गर्म रखें । नेत्र स्नेहक के साथ आंखों की रक्षा । एक बिजली के रेजर के साथ सिर पर फर दाढ़ी । एक सूती कली का उपयोग कर मुंडा सिर पर povidone आयोडीन फैलाओ । एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक midline चीरा लगाकर. खोपड़ी की सतह को रूई की कली से साफ कर लें, ताकि bregma और लैंब्डा दिखाई दे । इसके धारक में इंजेक्शन micropipette रखें । धारक को स्टीरियोटैक्टिक बांह में संलग्न करें । bregma और/या लैंब्डा के सापेक्ष इंजेक्शन की साइट के एक्स और वाई निर्देशांक निर्धारित करें । लक्ष्य क्षेत्र पर खोपड़ी पतली करने के लिए एक ड्रिल का प्रयोग करें ।नोट: कोमल परिपत्र आंदोलनों का प्रयोग करें और खोपड़ी के माध्यम से ड्रिलिंग से बचने के रूप में यह मस्तिष्क की सतह को नुकसान होगा । अगर खून बह रहा है, तौलिया कागज के साथ अत्यधिक खून को अवशोषित ।नोट: अत्यधिक रक्त यह मुश्किल सही ढंग से z समंवय निर्धारित करने के लिए कर देगा । लोड ≤ 2 वायरस के µ एल केशिका कार्रवाई द्वारा इंजेक्शन micropipette में । इंजेक्शन micropipette की साइट के एक्स और वाई निर्देशांक में ले आओ । की गणना z बाडी से समंवय और पिपेट धीरे मस्तिष्क में कम । जब जेड समंवय तक पहुंच गया है, 3 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए ऊतक समायोजन के लिए अनुमति देते हैं । एक 1 मिलीलीटर इंजेक्शन micropipette के पीछे एक लचीला ट्यूब के माध्यम से जुड़े सिरिंज का उपयोग कम सकारात्मक दबाव लागू करें. विजुअली माइक्रोस्कोप के माध्यम से इंजेक्शन micropipette से वायरस की बेदखली की गति की निगरानी और संदर्भ अंक के रूप में औजार के निशान का उपयोग.नोट: वायरस को ऊतक की क्षति से बचने के लिए धीमी दर (< 100 nL/ जब इंजेक्शन समाप्त हो गया है, 5 मिनट रुको, 0.2 mm द्वारा इंजेक्शन micropipette वापस लेने, एक और 5 मिनट के लिए रुको, वायरस के backflow से बचने के लिए । इंजेक्शन micropipette धीरे और पूरी तरह से मस्तिष्क से वापस लेने और एक ब्लीच के साथ भरा कंटेनर में इसका निपटान । शारीरिक समाधान के साथ खोपड़ी गीला और 3-4 टांके के साथ त्वचा टांका । घाव के लिए gentamicin मरहम लागू करें । एकल घर भोजन छर्रों के साथ एक साफ पिंजरे में पशु और एक गर्मी लैंप के तहत जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो । ≥ 15 दिनों के बाद इंजेक्शन, गहरी isoflurane संज्ञाहरण के तहत पशुओं decapitate । मार डाला का उपयोग कर एक Vibratome के साथ ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र के तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें तैयार (95% ओ 2, 5%कं2) आइस-कोल्ड aCSF सॉल्यूशन, जिसमें (एमएम में): 123 NaCl, 1.25 KCl, सवा KH2पीओ4, 1.5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate और 18 ग्लूकोज (osmolarity के लिए समायोजित 300 mOsm). उदाहरण के लिए, यदि उद्देश्य के लिए CA3 से synaptic संचरण का विश्लेषण करने के लिए है CA1 पिरामिडीय न्यूरॉन्स, हिप्पोकैम्पस गठन के sagittal स्लाइसें तैयार (350 µm मोटा).नोट: पर्यावरण प्रकाश द्वारा optogenetic जांच के सक्रियकरण से बचने के लिए कम प्रकाश शर्तों के तहत इस कदम से आगे काम करते हैं । स्लाइसें मस्तिष्क स्लाइस होल्डिंग के लिए बनाया गया एक चैंबर में एक ही aCSF में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठीक कर दें । रिकॉर्डिंग तक कमरे के तापमान पर एक ही मस्तिष्क स्लाइस चैंबर में स्लाइस रखें ।नोट: इन शर्तों का उपयोग करके, स्लाइस को 6 – 8 h तक के लिए स्वस्थ बनाए रखा जा सकता है । एक स्लाइस को जलमग्न रिकॉर्डिंग चैंबर में स्थानांतरित करें और superfuse 1.5 mm CaCl2 (कुल Ca2 +: 2.5 mm) और बिना NaPyruvate के साथ पूरक वसूली के लिए इस्तेमाल किया एक ही aCSF के 2 मिलीलीटर/नोट: स्लाइसें और तैयार कर रहे हैं Ca के कम एकाग्रता में बनाए रखा2 + (1 मिमी) विषाक्तता को कम करने के लिए. रिकॉर्डिंग 2.5 mM Ca2 + में प्रदर्शन कर रहे हैं पुटिका रिलीज एहसान करने के लिए । संक्षेप में व्यक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के संकेत की जांच करें (उदा TdTomato; चित्र बी) स्थानीयकरण और संक्रमण की तीव्रता का पता लगाने के लिए । (मिमी में) युक्त एक intracellular समाधान के साथ एक पैच इलेक्ट्रोड भरें: 110 k-gluconate, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 EGTA, 3 MgCl2, 4 एमजी-एटीपी, 0.5 Na3-GTP, 20 k2-creatine फॉस्फेट, 10 HEPES-कोह (पीएच ७.२८, 290 mΩ).नोट: 5-6 mΩ के एक पिपेट प्रतिरोध के साथ पैच इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. अवरक्त रोशनी के तहत, एक संक्रमित न्यूरॉन्स से synaptic आदानों प्राप्त न्यूरॉन से तंग सील पूरे सेल विन्यास तक पहुँचने. उदाहरण के लिए, यदि CA3 पिरामिड न्यूरॉन्स संक्रमित थे, CA1 क्षेत्र के औसत दर्जे का पथ के समीपस्थ में पिरामिड ंयूरॉंस पैच (चित्रा 3सी).नोट: श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा छोड़ा जा सकता है, लेकिन यह लगातार और कम होना चाहिए (≤ 20 MΩ). जांच के तहत synaptic धाराओं को अलग करने के लिए औषध विज्ञान का प्रयोग करें । उदाहरण के लिए, यदि उद्देश्य उत्तेजक synaptic ट्रांसमिशन की जांच करने के लिए है, तो ब्लॉक निरोधात्मक synaptic ट्रांसमिशन के साथ 10 µ m bicuculline. उदाहरण के लिए, synaptic धाराओं आह्वान, उत्तेजक postsynaptic धाराओं (EPSCs), एक 473 एनएम नीला एक ऑप्टिकल फाइबर के लिए मिलकर लेजर का उपयोग (Ø ≤ 250 µm) संक्रमित न्यूरॉन्स के सोमता पर तैनात (उदा CA3 पिरामिड न्यूरॉन्स) । एक ंयूनतम करने के लिए उत्तेजना की लंबाई समायोजित करें, प्रकाश पल्स प्रति एक से अधिक कार्रवाई की क्षमता पैदा करने की संभावना को कम । यदि ChETA का उपयोग कर, यह 2 ms15के लिए सेट करें । लेजर की उत्तेजना शक्ति को समायोजित करने के लिए छोटे लेकिन स्पष्ट रूप से पता लगाने synaptic धाराओं उपज (≤ 50 फिलीस्तीनी अथॉरिटी EPSCs के लिए पीक आयाम-CA3 और CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स के बीच 70 एमवी की एक पकड़ क्षमता पर दर्ज; चित्र 3d) । यदि ChETA और व्यास में 250 µm के एक ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर, 1 की उत्तेजना ताकत-फाइबर निकास पर 3 मेगावाट उपयुक्त होना चाहिए ।नोट: यदि लेजर ताकत विनियमित नहीं किया जा सकता है, तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करें । इस संक्रमित न्यूरॉन्स के सोमता पर 473 एनएम लेजर लाइट शाइन करें, लेकिन उनके axons पर नहीं । उदाहरण के लिए, CA3 सोमता पर प्रकाश चमक, और Schaffer जमानतों से दूर, axons के प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण से बचने के लिए । tetrodotoxin लागू करें (TTX; 0.5 µ m), सोडियम चैनलों के एक अवरोधक, नमूने के लिए चैनल की पुष्टि करने के लिए कार्रवाई की क्षमता संचालित कर रहे हैं. विभिंन रिकॉर्डिंग में, synaptic वर्तमान में जांच के तहत एक चयनात्मक अवरोधक लागू उत्तेजना चयनात्मक है पुष्टि करने के लिए ।नोट: उदाहरण के लिए, NBQX (10 µ m) AMPA-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर-मध्यस्थ EPSCs करने के लिए लागू होते हैं । दोहराव उत्तेजना (≥ 2 उत्तेजनाओं ≤ 20 हर्ट्ज पर) के जवाब में एक ही तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा में ऑप्टिकली और बिजली के synaptic धाराओं पैदा की तुलना करें । synaptic सुविधा या अवसाद के एक समान डिग्री विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजना के बीच मनाया जब एक नियंत्रण मीर का उपयोग किया जाना चाहिए, इस प्रकार का सुझाव है कि इसी तरह सेलुलर तंत्र उत्तेजना के दो प्रकार के द्वारा सक्रिय कर रहे हैं ।नोट: उपरोक्त कदम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि ऑप्टिकल उत्तेजना presynaptic बूटोंस के एक प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण प्रेरित नहीं करता है, इस प्रकार synaptic संचरण के कुछ तंत्र को दरकिनार । एक नियंत्रण मीर और miRs जांच के तहत presynaptic प्रोटीन लक्ष्यीकरण के बीच एक और दोहराव उत्तेजना (≤ 20 हर्ट्ज पर ≥ 2 उत्तेजनाओं के जवाब में synaptic संचरण की तुलना करें) ।
Representative Results
ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं एक मजबूत तरीका है कि कैसे synaptic संचरण presynaptic न्यूरॉन्स में synaptic प्रोटीन के पछाड़ना से प्रभावित है का आकलन करने के लिए प्रदान करते हैं । प्रतिनिधि परिणाम पर कैसे वैकल्पिक ब्याह के पछाड़ना isoforms के presynaptic Cav2.1 (पी/Q-type) VGCCs synaptic पर अल्पकालिक CA3 प्लास्टिक को नियंत्रित करता है CA1 उत्तेजक synapses एक उदाहरण के रूप में नीचे दिए गए हैं । Cav2.1 (P/Q-प्रकार) चैनल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सबसे तेज synapses में प्रमुख presynaptic VGCCs हैं । वैकल्पिक ब्याह के पारस्परिक रूप से अनंय exons 37a और 37b के ताकना के गठन α1 उपइकाई Cav2.1 (α1a) के दो प्रमुख वेरिएंट का उत्पादन, cav2.1 [EFa] और cav2.1 [EFb]16,17 ,18. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या cav2.1 [EFa] और cav2.1 [EFb] विभेदक रूप से चूहे हिप्पोकैम्पस पिरामिडीय न्यूरॉन्स में synaptic संचरण और प्लास्टिक को विनियमित करते हैं, हम पहली बार isoform-विशिष्ट miRs के लिए पछाड़ना चुनिंदा सीएवी विकसित 2.1 [EFa] या Cav2.1 [EFb]5. exons 37a और 37b के बीच कम आकार (97 बीपी) और उच्च समानता (न्यूक्लियोटाइड स्तर पर ६१.८६% पहचान) के बावजूद, हम चूहे के खिलाफ तीन मीर अनुक्रम डिजाइन कर सकते है Cav2.1 [EFa] (मीर EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; मीर EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; मीर EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) और चूहे के खिलाफ दो सीएv2.1 [EFb] (मीर EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; मीर EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) ने भविष्यवाणी की उच्च पछाड़ना दक्षता के साथ । नकारात्मक नियंत्रण (मीर नियंत्रण) के रूप में, हम pcdna 6.2-गिनीकृमि/EmGFP-मीर-नेग एक अनुक्रम है कि किसी भी ज्ञात हड्डीवाला जीन लक्ष्य नहीं है युक्त प्लाज्मिड का इस्तेमाल किया । heterologous चैनलों के खिलाफ HEK 293 कोशिकाओं में पहली स्क्रीन के आधार पर, हम मीर EFa1, मीर EFa3 और मीर EFb2 का चयन किया और सदिश UTR के 3 ‘ pAAV-Syn-ChETA-TdT-मीर-एक्स, जो rAAVs के उत्पादन के लिए बनाया गया है और जहां में उनकी अभिव्यक्ति कैसेट क्लोन synapsin प्रवर्तक ultrafast channelrhodopsin ChETA, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन TdTomato और डाला मीर (चित्रा 1) की अभिव्यक्ति ड्राइव । इस मीर की पछाड़ना कुशलता को बढ़ाने के लिए हमने मीर EFb2 की अभिव्यक्ति कैसेट को भी दोहराया. अगले, हम rAAV1/2 के ऊपर चार निर्माण के लिए तैयार है, और quantified उनकी पछाड़ना दक्षता और selectivity प्राथमिक चूहा ंयूरॉन संस्कृतियों में isoform-विशिष्ट qRT-पीसीआर का उपयोग कर । मीर EFa1 और मीर EFa3 देशी सीएv2.1 [EFa] के mRNA से कम ~ 70% लेकिन सीएv2.1 [EFb] की नहीं है कि, whilst मीर EFb मूल cav2.1 के mRNA कम [EFb] द्वारा ~ 60% लेकिन नहीं है कि Cav2.1 [EFa] (चित्रा 2) । हम तो stereotactically P18 चूहों के हिप्पोकैम्पस के CA3 क्षेत्र में चार rAAV1/2 में से प्रत्येक इंजेक्शन (चित्र 3-सी), के निर्देशांक के साथ (A-P/M-L/D-V से Bregma) − 2.6/± 2.9/− 2.9. पंद्रह से चौबीस दिनों के बाद इंजेक्शन, हम rAAV1 से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइसें तैयार/2-चूहों इंजेक्शन और TdTomato प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति और rAAVs के स्थानीयकरण (चित्र3) की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया. जांच करने के लिए कि क्या presynaptic पछाड़ना के या तो cav2.1 [EFa] या cav2.1 [EFb] synaptic पर CA3 CA1 में अल्पकालिक synapses की प्लास्टिकी प्रभावित, हम चुनिंदा के साथ संक्रमित CA3 ंयूरॉंस उत्तेजित संक्षिप्त 473 एनएम लेजर प्रकाश पल्स (2 ms-लांग ; चित्रा 3सी), और CA1 क्षेत्र (आंकड़ा 3सी) के औसत दर्जे का पथ के समीपस्थ में पिरामिड न्यूरॉन्स पैच द्वारा परिणामी EPSCs रिकॉर्ड किया गया. हमने पाया है कि सीए के पछाड़नाv2.1 ब्याह isoforms प्रभावित प्रतिक्रियाओं के लिए युग्मित-नाड़ी उत्तेजना विपरीत दिशाओं में: ca के पछाड़नाv2.1 [EFa] (मीर EFa1 या मीर EFa3) बढ़ाया युग्मित-पल्स सुविधा (पीपीएफ) जबकि सीए के पछाड़ना v2.1 [EFb] (मीर EFb2) ने इसे (चित्रा 3d, ई) समाप्त कर दिया । चित्र 1: ultrafast optogenetic जांच ChETA और isoform-विशिष्ट miRs cav2.1 [EFa] और cav2.1 [EFb] के खिलाफ की संयुक्त अभिव्यक्ति के लिए construction योजना । (क) rAAV का नक्शा निर्माण pAAV-Syn-ChETA-TdT-मीर-एक्स, एक synapsin प्रवर्तक (Syn), ultrafast channelrhodopsin ChETA से जुड़े TdTomato और, समीपस्थ 3 ‘ UTR में, एक सीएv2.1 ब्याह isoform-विशिष्ट मीर युक्त । दिखाया प्रतिबंध एंजाइमों एकल कटर हैं । (ख) शीर्ष, अभिव्यक्ति कैसेट की योजना । synapsin प्रवर्तक दोनों ChETA-TdTomato और एक isoform-विशिष्ट मीर की अभिव्यक्ति ड्राइव । नीचे, रिवर्स 21-न्यूक्लियोटाइड लक्ष्य अनुक्रम, जो मीर कैसेट का हिस्सा फार्म का पूरक । मीर EFb2 के लिए दो समान मीर कैसेट एक के बाद एक साथ आपस में व्यक्त किए गए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्र 2. सीएv2.1 [EFa] और सीएv2.1 [EFb] के लिए isoform-विशिष्ट miRs के पछाड़ना दक्षता और selectivity का मूल्यांकन । Isoform-आरएनए पर विशेष qRT-पीसीआर विश्लेषण 17-18 div प्राथमिक संस्कृतियों से पृथक rAAVs के साथ 6 div पर संक्रमित miRs लक्ष्यीकरण या तो सीएv2.1 [EFa] (मीर EFa1 और मीर EFa3) या cav2.1 [EFb] (मीर EFb2) । डेटा नकारात्मक नियंत्रण (मीर नियंत्रण) को सामान्यीकृत कर रहे हैं । मीर EFa1 और मीर EFa3 काफी और चुनिंदा सीएv2.1 [EFa] (n = 8 और 7 संस्कृतियों के mRNA कम, क्रमशः), जबकि मीर EFb काफी है और चुनिंदा सीएv2.1 के mRNA कम कर देता है [EFb] (n = 4 संस्कृतियों; * * * p < 0.001; एक तरफ़ा विश्लेषण Tukey-क्रेमर पोस्ट-टेस्ट) के बाद प्रसरण परीक्षण । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा Thalhammer, ए एट अल से अनुकूलित किया गया है । 5. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । चित्र 3. सीए की भूमिका का आकलनv2.1 [EFa] और cav2.1 [EFb] देशी हिप्पोकैम्पस में लक्षित उत्तेजना से optogenetics के साथ नीचे गिरा ंयूरॉंस । (क) rAAV के अभिव्यक्ति कैसेट की योजना विवो संक्रमण में इस्तेमाल के लिए प्रयोग की जाती है. (ख) हिप्पोकैम्पस खंड दिखा रहा है कि TdTomato प्रतिदीप्ति CA3 क्षेत्र और उसके अनुमानों तक ही सीमित है. (ग) प्रयोगात्मक विंयास: लेजर बीम CA3 सोमता पर निर्देशित किया गया था, और पैच दबाना रिकॉर्डिंग CA1 पिरामिड ंयूरॉंस से प्रदर्शन किया गया । (घ) 2 ms-लम्बा नीला (473 एनएम) लेजर लाइट दालों को 20 हर्ट्ज उदाहरण के EPSCs पर बिखेरती है जिसका पीपीएफ miRs लक्ष्यीकरण cav2.1 [EFa] द्वारा बढ़ा दिया जाता है औरv2.1 [EFb] के लिए मीर द्वारा समाप्त किया जाता है । (ङ) (D) के रूप में प्रयोगों के लिए युग्मित-पल्स अनुपात का सारांश, मीर EFa1 और मीर EFa3 के लिए पीपीएफ में वृद्धि दिखा रहा है और मीर EFb2 के लिए एक कमी, मीर नियंत्रण के सापेक्ष (n = 9-11 रिकॉर्डिंग; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p < 0.0004; सहप्रसरण का विश्लेषण) । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । यह आंकड़ा Thalhammer, ए एट अल से अनुकूलित किया गया है । 5. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
Discussion
सह एक optogenetic जांच की अभिव्यक्ति और ब्याज की एक presynaptic जीन के खिलाफ एक मीर एक शक्तिशाली दृष्टिकोण को बरकरार न्यूरॉन सर्किट के भीतर presynaptic समारोह पर जीन पछाड़ना के प्रभाव को चिह्नित करता है । इस प्रायोगिक दृष्टिकोण के लिए, यह महत्वपूर्ण है की पहचान करने के लिए और miRs कि अत्यधिक कुशल है और नीचे में देशी प्रणालियों में ब्याज की जीन दस्तक में चयनात्मक विशेषताएं । यदि संभव हो, तो ब्याज की एक ही mRNA के खिलाफ दो या अधिक स्वतंत्र miRs अंततः बंद लक्ष्य प्रभाव के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए । बचाव प्रयोग, जिसमें एक मीर प्रतिरोधी जीन प्रणाली में पुनः शुरू है, विशिष्टता के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
एक ही निर्माण का उपयोग करने के लिए एक optogenetic जांच एक्सप्रेस और एक मीर ऑप्टिकली केवल presynaptic ंयूरॉंस कि हेरफेर किया गया है उत्तेजक के लिए अनुमति देता है । इस विद्युत उत्तेजना के साथ संभव नहीं है क्योंकि वे संक्रमित और गैर संक्रमित ंयूरॉंस के बीच भेद नहीं है, इस प्रकार मिश्रित और पतला परिणाम उत्पादन । क्योंकि ऑप्टिकल उत्तेजना कई कार्रवाई क्षमता15पैदा कर सकते हैं, यह एक विस्तार पैलेट15,19,20,21के बीच केवल सबसे तेजी से optogenetic जांच का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि ऑप्टिकल उत्तेजना presynaptic बूटोंस के एक प्रत्यक्ष ध्रुवीकरण प्रेरित नहीं करता है, synaptic ट्रांसमिशन के कुछ चरणों को दरकिनार करने से बचने के लिए एक इच्छाओं को22की जांच ।
प्रयोगात्मक दृष्टिकोण हम यहां का वर्णन है, यह एक सीमित समय अवधि के भीतर ब्याज की एकाधिक presynaptic जीन की शारीरिक प्रासंगिकता समानांतर में मूल्यांकन करने के लिए संभव बनाता है (4-6 महीने) । हालांकि, यह ध्यान रखें कि knockdowns शायद ही कभी 100% तक पहुंचने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, rAAVs के लिए व्यक्त की जरूरत है कम से कम दो सप्ताह के लिए अधिक से अधिक पछाड़ना और optogenetic जांच है, जो एक समय बाधा जब जल्दी विकास प्रक्रियाओं की जांच का प्रतिनिधित्व कर सकते है की पूर्ण अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि अधिक समय लेने, सशर्त नॉकआउट चूहों presynaptic ंयूरॉंस तक सीमित है, आम तौर पर ब्याज की जीन की पूरी हटाने में परिणाम और इसलिए एक वैध पूरक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।
मीर प्रौद्योगिकी का एक विशिष्ट लाभ यह है कि यह एक ही प्रमोटर से कई miRs की अभिव्यक्ति में सक्षम बनाता है । इस गुण का मुख्य रूप से एक ही लक्ष्य जीन के विरुद्ध एक ही मीर या विभिन्न miRs की एकाधिक प्रतियां सम्मिलित करके पछाड़ना दक्षता बढ़ाने के लिए प्रयोग किया गया है. लेकिन यह भी इस्तेमाल किया जा सकता है विभिंन लक्ष्य जीन7,23के खिलाफ miRs व्यक्त द्वारा कई जीन पछाड़ना । इस संपत्ति के लिए कई presynaptic प्रोटीन मौन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है presynaptic संकेतन रास्ते काटना ।
यहाँ, हम तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में presynaptic समारोह पर जीन पछाड़ना के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए कृत्रिम miRs के साथ संयुक्त optogenetics है. एक समान दृष्टिकोण भी vivo मेंहेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और जांच ंयूरॉन सर्किट । इसके अलावा, chemogenetic दृष्टिकोण के साथ कृत्रिम miRs संयोजन एक लंबे समय तराजू पर न्यूरॉन सर्किट से पूछताछ करने के लिए सक्षम होगा.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम समर्थन और प्रदर्शन के साथ मदद करने के लिए कर्मेला Vitale के लिए एफ Benfenati (Istituto इतालवी di Tecnologia, आईआईटी) धंयवाद । यह काम आईआईटी और Compagnia सान पाओलो (अनुदान no. ९७३४ से एलएसी) द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer’s guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
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Thalhammer, A., Jaudon, F., Cingolani, L. A. Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits. J. Vis. Exp. (133), e57223, doi:10.3791/57223 (2018).