Ved at kombinere Optogenetics med kunstige MicroRNA at karakterisere effekter af genet Knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt Neuronal kredsløb
Summary
Denne protokol indeholder en arbejdsproces i at kombinere kunstige mikroRNA-medieret RNA-interferens med optogenetics at stimulere specifikt præsynaptiske boutons med reducerede udtryk for selektiv molekylærgenetisk inden for intakt neuronal kredsløb.
Abstract
Formålet med denne protokol er at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. Vi beskriver en arbejdsproces på hvordan man kan kombinere kunstige mikroRNA (miR)-medieret RNA-interferens med optogenetics at opnå selektiv stimulation af manipulerede præsynaptiske boutons i akut hjernen skiver. Den eksperimentelle tilgang indebærer anvendelse af en enkelt viral konstruktion og en enkelt neuron-specifik initiativtager til at drive udtryk for både en optogenetic sonde og kunstige miR(s) mod præsynaptiske molekylærgenetisk. Når stereotactically injiceres i det pågældende område, hjernen, gør den udtrykte konstruktion det muligt at stimulere med lys udelukkende neuroner med reducerede udtryk for molekylærgenetisk under undersøgelsen. Denne strategi kræver ikke udvikling og vedligeholdelse af genmodificerede mus linjer og kan i princippet anvendes til andre organismer og enhver neuronal gen af valg. Vi har for nylig anvendt det for at undersøge, hvordan knockdown af alternative splice isoformer af præsynaptiske P/Q-type spænding-gated calcium kanaler (VGCCs) regulerer kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 ophidsende synapser i akut hippocampus skiver. En lignende fremgangsmåde kan også bruges til at manipulere og sonde neuronal kredsløb in vivo.
Introduction
Denne protokol beskriver en ny tilgang for at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. Undersøge præsynaptiske funktion i intakt neuronal kredsløb udfordrende, fordi mange præsynaptiske boutons er for små og langt væk fra soma at tillade kombineret molekylære og elektrofysiologiske interventioner. Selv RNA-interferens tilbyder en kraftfuld og fleksibel metode til knockdown synaptic proteiner1, har denne tilgang været brugt sparsomt at undersøge præsynaptiske funktion, fordi det er vanskeligt at påvise effekten af knockdown ved hjælp af traditionelle elektrisk stimulering, der ikke skelner mellem manipuleret og naive præsynaptiske boutons2. Her, vi beskriver, hvordan du kombinere kunstige mikroRNA (miR)-medieret RNA-interferens med nyligt udviklede optogenetic teknologi til at opnå selektiv stimulation af manipulerede præsynaptiske boutons i akut hjernen skiver.
Mens betinget knockout mus i kombination med Elektrofysiologi kunne også bruges til at undersøge funktionen af præsynaptiske proteiner3,4, kræver vores strategi ikke udvikling og vedligeholdelse af genetisk modificeret mus linjer og også nemt kan være ansat for at vælte specifikke isoformer af et gen. I forhold til mere almindeligt brugte kort hårnål RNA’er (shRNAs), kunstige miRs, som vi anvender her, tilbyder vigtige fordele for knockdown i neuroner. I modsætning til shRNAs, kan de udtrykkes under kontrol af en polymerase II promotor1. Således, en enkelt promotor kan bruges til at drive udtryk for både miR og en optogenetic sonde, sammen med en fluorescerende reporter. På denne måde, kan størrelsen af konstruktionen holdes inden emballagen for rekombinante adeno-associeret virus (rAAV, figur 1A). Også, brug af en enkelt konstruktion og en enkelt promotor reducerer eksperimentel variation fordi det giver mulighed for udtryk for miR, optogenetic sonde og fluorescerende reporter i et fast forhold.
Vi har for nylig anvendt denne teknologi til at undersøge rollen, som alternativt splejset isoformer af præsynaptiske calcium kanaler i hippocampus5. En sådan strategi er generelt gælder for at studere den fysiologiske relevansen af andre presynaptically udtrykte proteiner i enhver hjernen kredsløb af interesse.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjer fastlagt af det europæiske samfund Råd (direktiv 2010/63/EU af 4 marts 2014), og blev godkendt af det italienske sundhedsministerium. 1. design af MicroRNA for RNA-interferens og evaluering af deres effektivitet i heterolog udtryk systemer Bemærk: Denne protokol kræver viden om de følgende veletablerede metoder: Molekylær kloning, DNA-sekventering, vedligeholdelse af cellelinjer, calciumphosphat Transfektion, kvantitative real time PCR (qRT-PCR), forberedelse af cellelysater fra cellelinjer og Western blotting. Afgøre, om gen af interesse er underlagt alternativ splicing. For en generel knockdown af genet, Vælg udelukkende konstitutiv exons; et knockdown af et bestemt alternativt splejset isoform, Vælg den relevante alternativt splejset exon. Bruge dedikeret software (f.eks. https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) til at designe kunstige miRs for RNA-interferens mod rækkefølgen af interesse.Bemærk: Det er vigtigt at bruge en grundlæggende lokale justering søgning værktøj (BLAST) til at kontrollere for mulige off-mål inden for samme art. Vælg de øverste tre rangeret miRs for mål-genet. Bestil de øverste og nederste dele af de valgte miRs fra en egnet virksomhed. For negativ kontrol bruge en forvrænget version af en de valgte miRs eller en miR forudsagt ikke for at målrette nogen kendte gen af de arter, der anvendes i forsøget (fx. til hvirveldyr gener, miR i pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg). Bind de respektive øverste og nederste dele af de valgte miRs og klone dem ind i et plasmid designet til udtryk for miRs (f.eks. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) ved hjælp af standard kloning strategier.Bemærk: Målet er at skabe en miR udtryk kassette består af en 5′ miR flankerende region, valgte miR sekvens og en 3′ miR flankerende region, som kan udtrykkes fra 3′ UTR af et reporter gen under kontrol af et RNA-polymerase type II promotor. Bruge DNA sekvens til at validere den korrekte indsættelse af de valgte miRs. Vokse HEK293 celler i en fugtig celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2) ved hjælp af DMEM medium suppleret med 10% føtal bovint serum, 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) og 1 x penicillin/streptomycin (Pen/Strep). Når HEK293 celler er ~ 70% sammenflydende, co transfect dem med hver af miR udtryk vektorer og en vektor udtrykker det målrettede genet i forholdet 1:1 DNA ved hjælp af calciumphosphat metode6. Omfatter følgende kontrolelementer: (i) untransfected celler, (ii) celler transfekteret med vektoren udtrykker det målrettede genet sammen med enten bærer-DNA’ET (f.eks. pBluescript II SK(+)) eller (iii) miR kontrol.Bemærk: (i) den udtrykte målrettede gen skal være fra samme art som miRs var designet, medmindre de sekvenser, der er ramt af miRs bevares absolut på nukleotid niveau mellem de to arter. (ii) cellelinjer end HEK293 kan bruges. (iii) alternative metoder til Transfektion, såsom elektroporation eller Liposom-baserede metoder, kan anvendes. 48 timer efter Transfektion, lyse celler, køre protein gel, udføre vestlige skamplet og analysere proteinindhold med et antistof anerkende target proteinet. Målet for et knockdown effektivitet af ≥50%.Bemærk: Knockdown effektivitet kan alternativt eller Derudover vurderes (i) af ELISA analyse, (ii) ved at måle aktivitet af target proteinet eventuelt (fx strømtætheder for Ionkanaler) eller (iii) af qRT-PCR på mRNA niveau hvis egnet antistoffer er ikke tilgængelige (protokol trin 3). Placere kultur retter på is og vaske cellerne en gang med iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Opsug PBS, derefter tilføje iskold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP40, 0,1% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), der indeholder protease og fosfatase hæmmere; 1 mL til en parabol af Ø 100 mm, 0,5 mL til et fad Ø 60 mm). Skrab vedhængende celler fra fadet ved hjælp af en celle skraber og forsigtigt overføre cellesuspension ind en pre afkølede microcentrifuge røret. Centrifugeres tube på 15.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, overføre supernatanten i en ny pre afkølede microcentrifuge tube og kassér pelleten. Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af BCA Protein Assay kit eller anden egnet metode (f.eks. Bradford assay).Bemærk: Prøver kan enten være frosset ved-20 ° C eller-80 ° C til senere brug, eller forarbejdes straks. Overføre et passende volumen af lysates til microcentrifuge rør, så alle prøver har den samme proteinkoncentration og tilføje passende iskold lysisbuffer at indhente alle lysates den samme volumen.Bemærk: 30 til 50 µg af total protein bør være tilstrækkeligt for de fleste af proteiner, men den relevante mængde der skal lastes bør fastlægges efter overfloden af protein af interesse. Tilføje en passende mængde 2 x Laemmli buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromophenol blå, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) og kog prøver ved 95 ° C i 5 min. Indlæse prøver på en acrylamid gel sammen med en molekylevægt markør. Kør gelen på 100 V i 1-2 timer.Bemærk: Gel Procenten afhænger størrelsen af protein af interesse. Samle overførsel sandwich og overføre proteinerne fra gel på en membran på 100 V til 2 h. Membranen kan være enten nitrocellulose eller PVDF. Aktivere PVDF med methanol i 1 min. og skyl det med overførsel buffer før forberede stakken. Blokere membran i 1 time ved stuetemperatur med blokerende buffer (5% mælk i PBST (PBS + 0,1% Tween-20)), derefter inkuberes membran natten over ved 4 ° C med primær antistof fortyndet i blokerende buffer. Vask membran i 10 min i PBST tre gange, og der inkuberes det med HRP-konjugerede sekundær antistof i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Vask membran i 10 min i PBS fire gange, derefter anvende den kemiluminescens substrat til membranen og fange de kemiluminescens signaler ved hjælp af en CCD kamera-baserede imager. Brug billede analyse software til at kvantificere de knockdown effektivitet. Vælg de to mest effektive miRs rettet mod ikke-overlappende sekvenser for yderligere funktionelle assays.Bemærk: Off mål effekter kan aldrig helt udelukkes for enhver miR. Hvis to uafhængige miRs har en lignende effekt, er det imidlertid yderst usandsynligt, at dette er på grund af en samme off target knockdown. Hvis de valgte miRs knockdown effektivitet ikke er tilfredsstillende (< 50%), skærm for andre miRs. Alternativt udtrykke udtrykke de mest effektive miR(s) i tandem, dvs dem i flere kopier af samme udtryk kassetten, hvilket kan resultere i øget knockdown effektivitet7. 2. opførelsen af rekombinant Adeno-associeret vektorer for kombineret udtryk af sonder Optogenetic og MicroRNA Bemærk: Denne protokol kræver viden om de følgende veletablerede metoder: Molekylær kloning, DNA-sekventering og rAAV produktion. Klon af de mest effektive miR udtryk kassetter i 3′ UTR af konstruktioner designet til produktion af rekombinante rAAVs og udtryk for excitatoriske optogenetic sonder, som i pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (figur 1A), hvor den neuron-specifik synapsin promotor drives udtryk for den ultrahurtig channelrhodopsin ChETA, rødt fluorescerende reporter TdTomato, og miR(s) indsættes mellem NheI og EcoRI sites5.Bemærk: (i) ikke overgå den emballage grænse for rAAVs, som er ca. 4,7 Kb i længden fra ITR (inverteret terminal gentagelse) til ITR (figur 1A, orange). (ii) miR udtryk kassette skal indsættes mellem stop codon og WPRE (Woodchuck Hepatitis Virus posttranskriptionelle regulerende Element; Figur 1A). (iii) optagelse af et fluorescerende proteiner, såsom TdTomato, er meget nyttigt, da det giver mulighed for let overvågning lokalisering og intensiteten af infektion (protokol trin 4). Bruge DNA sekvens til at validere den korrekte indsættelse af miR-kassetter. Råvarer og titer rAAV1/2 tidligere udgivne protokol8, en rAAV1/2 for hver valgte miR. En typisk eksperiment for knockdown af ét gen vil omfatte to uafhængige miRs mod samme gen og én miR kontrol. Målet for en virus titer af ≥109 viral genomer (vg) / µL.Forsigtig: rAAVs skal håndteres i et anlæg, biosikkerhed niveau 1 (BSL-1). Tjek venligst med institutionelle biosikkerhed Udvalget detaljerede oplysninger.Bemærk: Hvis laboratoriet ikke har en viral facilitet eller hvis viral titers ikke er tilfredsstillende, rAAV produktion kan outsources. For eksempel, besøg https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ eller https://vcf.charite.de/en/metas/. 3. udvinding af RNA fra primære Neuronal kulturer for evaluering af miR Knockdown effektivitet af endogene gener af qRT-PCR Bemærk: (i) denne protokol kræver viden om de følgende veletablerede metoder: forberedelse og vedligeholdelse af primære neuronal kulturer og qRT-PCR. (ii) Gentag kvantificering af knockdown effektivitet (trin 3.1 – 3.14) mindst 3 gange (biologiske replikater). (iii) skøn over knockdown effektivitet på mRNA niveau af qRT-PCR egner sig når en analyse af proteinindholdet er udelukket, såsom Hvornår banke alternativt splejset isoformer som specifikke antistoffer ikke er tilgængelige5. Forberede primære neuronal kulturer fra regionen hjernen af interesse. Følge protokollen for kortikale kulturer i tidligere publikation9, med følgende ændringer: Plade neuroner i 6 godt plader med en tæthed på 500.000 neuroner pr. brønd. Bruge 2,5 mL/brønd af vedhæftet fil medium og 3,3 mL/godt af vedligeholdelse medium. Hvis astrocyte overvækst er observeret, tilføje 0,5 mL/brønd af vedligeholdelse medium suppleret med 7,5 µM af cytosin β-D-arabinofuranoside (til en endelig koncentration på 1 µM) på 3 – 4 dage i vitro (DIV). Inficere tre brønde pr. miR (tekniske replikater) på 5–6 DIV. Brug den laveste infektiøse dosis, som vil inficere ≥99% af neuroner. Fjern 2 mL medium fra hver brønd og samle det i en 50 mL falcon tube. Tilføje virus direkte til neuroner, blandes forsigtigt og læg pladerne tilbage i varmeskab ved 37 ° C. Gemme de indsamlede medium i rugemaskinen. Løs hætten af falcon tube at give gas ækvilibrering. Efter 24 timer, skal du tilføje de fjernede medium tilbage i hver brønd (1,9 mL/hul). Ved 17–18 DIV, lyse neuroner for RNA udvinding.Forsigtig: Lysis reagens og chloroform er meget giftige. Arbejde under en kemisk hætte og slid beskyttende gear; bortskaffelse af affald ifølge din nationale og institutionelle retningslinjer.Bemærk: Trin 3.3 – 3.13, arbejde i RNAse-fri betingelser. Bære handsker og bruge RNAse-fri glas og engangs plasticware. For generelle forholdsregler om, hvordan man håndtere RNA, konsultere f.eks Appendiks A af RNeasy Micro håndbogen tilgængelige online. Inkuber glas Pasteur pipetter natten over i en ovn ved 180 ° C. Vippe pladerne og Opsug medium helt fra hver brønd med en glas Pasteur pipette tilsluttet en vakuumpumpe. Straks tilføje 700 µL Lysis reagens til hver brønd. Jævnt løsningen af vuggende og ryste pladen omhyggeligt og kort i hånden. Afpipetteres løsningen op og ned 4 – 5 gange eller indtil en homogen suspension opnås. Opløsningen overføres fra hver brønd til en separat 1,5 mL Eppendorf tube.Bemærk: Cellelysater kan opbevares ved-80 ° C eller behandlet straks. Hvis det kræves, afrim celle lysates på RT, og Fortsæt til trin 3.5, straks. Tilføje 140 µL chloroform til hver prøve af cellelysater.Bemærk: Chloroform er flygtige og svære afpipetteres, Luk Eppendorf-rør så hurtigt som muligt. Ryst Eppendorf-rør kraftigt i 15 s, eller indtil prøverne er fuldt emulgeret. Holde prøven på RT for 1-2 min, eller indtil de flydende faser begynder at adskille. Centrifugeres prøver på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Overføre den øverste vandfasen (~ 320 µL) indeholdende RNA til en ny Eppendorf-rør, og kassér resterende væske.NOTE: Rør ikke den lavere pink organiske fase eller den hvide ring mellem de to faser med spidsen af en pipette. Tilføje 1,5 mængder af 100% ethanol (480 µL) til den vandige fase, og afpipetteres løsning langsomt op og ned 3 gange at blande. Rense RNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit designet til oprensning af RNA fra små prøver. Kvantificere RNA koncentration og prøve renhed med et spektrofotometer.Bemærk: (i) forventer udbytte af ≥3.5 µg/godt; 260/280 og 260/230 nøgletal for renhed over proteiner og organiske forbindelser bør både være ≥1.9. (ii) RNA prøver kan opbevares ved-80 ° C eller behandlet straks. Retrotranscribe 250, 500 eller 1000 ng af RNA med et kommercielt tilgængeligt kit. Kvantificere knockdown effektivitet for den endogene gen af interesse ved qRT-PCR. For en detaljeret protokol, se reference10. Målet for et knockdown effektivitet af ≥60% (figur 2). Normalisere dataene til ≥2 husholdning gener (fx. GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) ved hjælp af flere interne kontrol gen metode11.Bemærk: Hvis arbejder i rotte, bruge de følgende PCR primere for rengøring gener: GAPDH-fwd: 5′ GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3′ og GAPDH-rev: 5′ GATGATGACCCTTTTGGC 3′; ACTB-fwd: 5′ CATCACTATCGGCAATGAGC 3′ og ACTB-rev: 5′ TCATGGATGCCACAGGATT 3′; TUBB3-fwd: 5′ GCCTTTGGACACCTATTCAG 3′ og TUBB3-rev: 5′ TCACATTCTTTCCTCACGAC 3′; PPIA-fwd: 5′ CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3′ og PPIA-rev 5′ CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3′. 4. vurdering af præsynaptiske proteiner i intakt Neuronal kredsløb ved målrettet stimulering af bankede-nede neuroner med Optogenetics rolle Bemærk: Følgende protokol kræver tidligere erfaringer med elektrofysiologiske optagelser i akut hjernen skiver og adgang til en elektrofysiologiske setup. Stereotactically indsprøjtes rAAV1/2 i hjernen efter en detaljeret protokol i tidligere publikation12. Bestemme de stereotactic koordinater til regionen hjernen af interesse ved hjælp af stereotactic Atlas for musen13 eller rotte hjernen14. Bruge en mikropipette aftrækker for at trække injektion Mikropipetter med lange skafter af Ø 7 – 9 µm; klip injektion Mikropipetter på tand med en saks. Brug en tynd markør og millimeterpapir for at placere kalibrere mærker på injektion Mikropipetter hver 2 mm. Bedøver dyr med isofluran og ordne det i det stereotactic apparat. Holde dyret varm under hele operationen med en varmepude sat til 37 ° C. Beskyt øjnene med okulær smøremiddel. Barbere pels på hovedet med en barbermaskine. Sprede povidon-jod på glatbarberet hoved ved hjælp af en vatpind. Under et dissekere mikroskop, lave en midterlinjen snit. Ren kraniet overflade med en vatpind, så at synliggøre de bregma og lambda. Placere injektion mikropipette i holderen. Vedhæfte indehaveren på stereotactic arm. Bestemme x og y koordinater af injektionsstedet i forhold til bregma og/eller lambda. Brug en boremaskine til at tynde kraniet over målområdet.Bemærk: Brug blide cirkulære bevægelser og undgå at bore gennem kraniet, da dette vil skade overfladen af hjernen. Hvis der er blødning, absorbere overdreven blod med håndklæde papir.Bemærk: Overdreven blod vil gøre det vanskeligt at fastslå korrekt z koordinat. Indlæse ≤2 µL af virus i injektion mikropipette af kapillaritet. Bringe injektion mikropipette til x- og y-koordinaterne for injektionsstedet. Beregne z koordinaten fra dura og sænke pipetten langsomt ind i hjernen. Når z koordinat er nået, vente 3 minutter at give mulighed for justering af væv. Anvende lavt overtryk ved hjælp af en 1 mL sprøjte forbundet via en fleksibel slange til bagsiden af injektion mikropipette. Kontrollere visuelt hastigheden for udslyngning af virus fra injektion mikropipette gennem dissektion mikroskop og ved hjælp af en kalibrering markerer som referencepunkter.Bemærk: Virus skal injiceres med langsom hastighed (< 100 nL/min.) at undgå vævsskader. Når injektionen er færdig, vente 5 min, inddrage indsprøjtning mikropipette 0,2 mm, vente til en anden 5 min, at undgå tilbageløb af virus. Trække injektion mikropipette langsomt og helt fra hjernen og bortskaffe det ind i en container fyldt med blegemiddel. Våd kraniet med fysiologiske løsning og sutur i huden med 3-4 Sting. Anvende gentamicin salve til såret. Single-hus dyr i et rent bur med mad pellets og under en varmelampe indtil det fuldt ud genopretter. ≥15 dage efter injektion, halshugge dyr under dyb isofluran anæstesi. Forberede akut hjernen skiver af regionen hjernen af interesse med en Vibratome ved hjælp af gasset (95% O2, 5% CO2) iskold aCSF løsning, der indeholder (i mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH2PO4, 1,5 MgCl2, 1 CaCl2, 25 NaHCO3, 2 NaPyruvate og 18 glukose (osmolaritet justeret til 300 mOsm). For eksempel, hvis formålet er at analysere synaptiske transmission fra CA3 til CA1 pyramideformet neuroner, forberede sagittal skiver af hippocampus dannelse (350 µm tykt).Bemærk: Fra dette trin og fremefter arbejde under dårlige lysforhold at undgå aktivering af optogenetic sonde af miljømæssige lys. Lad skiverne inddrive i 30 minutter ved 37 ° C i den samme aCSF i et kammer, der er designet til at holde hjernen skiver. Holde skiver i den samme hjerne skive afdeling ved stuetemperatur indtil optagelse.Bemærk: Ved hjælp af disse betingelser, kan skiver opretholdes sundt for op til 6-8 h. Overførsel, man skær til en neddykket optagelse kammer og superfuse det med 2 mL/min. af de samme aCSF anvendes til recovery suppleret med 1,5 mM CaCl2 (i alt Ca2 +: 2,5 mM) og uden NaPyruvate.Bemærk: Skiver er udarbejdet og vedligeholdes i lav koncentration af Ca2 + (1 mM) til at minimere toksicitet. Optagelser er udført i 2,5 mM Ca2 + at favorisere vesikel frigivelse. Kontrollere kortvarigt signalet fra den udtrykte fluorescerende reporter (fx. TdTomato; Figur 3B) at undersøge de lokalisering og intensiteten af infektion. Fyld en patch elektrode med en intracellulær løsning indeholdende (i mM): 110 K-gluconat, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 EGTA, 3 MgCl2, 4 Mg-ATP, 0,5 Na3-GTP, 20 K2-kreatin fosfat, 10 HEPES-KOH (pH 7.28, 290 MΩ).Bemærk: Brug patch elektrode med en pipette resistens af 5 – 6 MΩ. Under infrarød belysning, nå tæt forsegling hele-celle konfiguration fra en neuron modtager synaptic input fra de inficerede neuroner. For eksempel, hvis CA3 pyramideformet neuroner var inficeret, patch pyramideformet neuroner i den proksimale til mediale tarmkanalen af regionen CA1 (figur 3 c).Bemærk: Serie modstand kan være efterladt ukompenserede, men det bør være konstant og lav (≤20 MΩ). Brug farmakologi for at isolere de synaptiske strømme omfattet af undersøgelsen. For eksempel, hvis formålet er at undersøge excitatoriske synaptisk transmission, blokere hæmmende synaptisk transmission med 10 µM bicuculline. Fremmane synaptic strømninger, eksempelvis excitatoriske postsynaptiske strømme (EPSCs), ved hjælp af en 473 nm blå laser koblet til en optisk fiber (Ø ≤250 µm) placeret på somata af de inficerede neuroner (fx. CA3 pyramideformet neuroner). Justere stimulation længde til et minimum, mindske muligheden for fremmane mere end én aktionspotentialet pr. lys puls. Hvis du bruger ChETA, sæt den til 2 ms15. Justere stimulation styrken af laser til at give små men klart påviselige synaptic strømme (≤50 pA peak amplitude for EPSCs indspillet på en bedrift potentiale -70 mV mellem CA3 og CA1 pyramideformet neuroner; Figur 3D). Hvis du bruger ChETA og en optisk fiber af 250 µm i diameter, bør stimulation styrker af 1 – 3 mW på fiber frakørsel være egnede.Bemærk: Hvis laser styrke ikke kan reguleres, brug neutralfiltre. Skinne 473 nm laserlys på somata af de inficerede neuroner, men ikke på deres axoner. For eksempel, skinne lyset på CA3 somata, og fra Schaffer soeskende at undgå direkte depolarisering af axoner. Anvende tetrodotoxin (TTX; 0,5 µM), en blokering af natrium kanaler, at prøve at bekræfte kanalerne aktionspotentialet-drevet. I forskellige optagelser, skal du anvende en selektiv blokering til den synaptiske aktuelle under undersøgelsen at bekræfte stimulation er selektiv.Bemærk: For eksempel anvende NBQX (10 µM) til AMPA-type glutamat receptor-medieret EPSCs. Sammenlign optisk og elektrisk evoked synaptic strømninger i den samme akut hjernen skive som reaktion på gentagne stimulation (≥2 stimuli på ≤20 Hz). En tilsvarende grad af synaptic facilitering eller depression bør overholdes mellem elektrisk og optisk stimulation når du bruger en kontrol miR, hvilket tyder på, at lignende cellulære mekanismer er aktiveret af de to typer af stimulering.Bemærk: Ovenstående trin er nødvendige for at sikre, at optisk stimulation ikke fremkalde en direkte depolarisering af præsynaptiske boutons, derved omgåelse nogle mekanismer af synaptisk transmission. Sammenlign synaptisk transmission i svar til enkelt og gentagen stimulering (≥2 stimuli på ≤20 Hz) mellem en kontrol miR og miRs rettet mod de præsynaptiske proteiner under undersøgelsen.
Representative Results
De procedurer, der er beskrevet ovenfor giver en robust metode til at vurdere hvordan synaptisk transmission påvirkes af knockdown synaptic proteiner i præsynaptiske neuroner. Repræsentative resultater på hvordan knockdown alternativ splejse isoformer af præsynaptiske Cav2.1 (P/Q-type) VGCCs regulerer kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 ophidsende synapser gives nedenfor som et eksempel. Cav2.1 (P/Q-type) kanaler er de fremherskende præsynaptiske VGCCs på mest hurtig synapser i centralnervesystemet. Alternativ splicing af de gensidigt eksklusive exons 37a og 37b af poreformede α1 underenhed af Cav2.1 (α1A) producerer to store varianter, Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. For at afgøre, om Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] varierende regulere synaptisk transmission og plasticitet i rotte hippocampus pyramideformet neuroner, vi først udviklet isoform-specifikke miRs til knockdown selektivt Cav 2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb]5. Trods den korte størrelse (97 bp) og høj lighed (61.86% identitet på niveauet nukleotid) mellem exons 37a og 37b, vi kunne designe tre miR sekvenser mod rotte Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) og to mod rotte Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) med forventet høj knockdown effektivitet. Som negativ kontrol (miR kontrol) brugte vi pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmid som indeholder en sekvens der ikke gør indskyde nogen kendte hvirveldyr genet. Baseret på en første skærmbillede i HEK 293 celler mod heterolog kanaler, vi valgt miR EFa1, miR EFa3 og miR EFb2 og klonede deres udtryk kassetter i 3′ UTR af vektoren pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, som er beregnet til produktion af rAAVs og hvor de synapsin promotor drev udtryk for den ultrahurtig channelrhodopsin ChETA, den røde fluorescerende protein TdTomato og de indsatte miR (figur 1). Vi også duplikeres udtryk kassette af miR EFb2 at øge denne miR knockdown effektivitet. Næste, vi forberedte rAAV1/2 for de ovennævnte fire konstruktioner, og kvantificeret deres knockdown effektivitet og selektivitet i primære rotte neuronal kulturer ved hjælp af isoform-specifikke qRT-PCR. miR EFa1 og miR EFa3 reduceret mRNA af indfødte Cav2.1 [EFa] af ~ 70%, men ikke de Cav2.1 [EFb], mens miR EFb reduceret mRNA af indfødte Cav2.1 [EFb] af ~ 60%, men ikke de Cav2.1 [EFa] (figur 2). Vi så stereotactically injiceres hver af de fire rAAV1/2 CA3 område af hippocampus P18 rotter (figur 3A-C), med koordinater (A-P/M-L/D-V fra Bregma) −2.6 / ± 2.9 / −2.9. Femten til tyve-fire dage efter injektionen, vi forberedt akut hippocampus udsnit fra rAAV1/2-indsprøjtning rotter og brugt TdTomato fluorescens for at bekræfte udtryk og lokalisering af rAAVs (figur 3B). For at undersøge, om præsynaptiske knockdown enten Cav2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb] berørt kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 synapser, stimuleret vi selektivt inficerede CA3 neuroner med korte 473 nm laser lys pulser (2 ms-lange ; Figur 3 c), og indspillede de resulterende EPSCs af lappe pyramideformet neuroner i den proksimale til mediale tarmkanalen af regionen CA1 (figur 3 c). Vi fandt, at knockdown af Cav2.1 splice isoformer påvirkede svar til parret impuls stimulation i modsatte retninger: knockdown Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 eller miR EFa3) boostet parret puls facilitering (PPF) mens knockdown ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) afskaffet det (figur 3D, E). Figur 1: Ordning af konstruktioner for kombinerede udtryk for ultrahurtig optogenetic sonde ChETA og isoform-specifikke miRs mod Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. (A) kort over rAAV konstruere pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, der indeholder en synapsin promoter (Syn), ultrahurtig channelrhodopsin ChETA sammenvokset til TdTomato, og i den proksimale 3′ UTR, en Cav2.1 splice isoform-specifikke miR. Restriktionsenzymer vist er enkelt kuttere. (B) Top, ordning af udtryk kassette. Synapsin selskabet drev udtryk for både ChETA-TdTomato og en isoform-specifikke miR. Bunden, reverse supplement af 21-nukleotid target-sekvenser, der indgår i miR kassette. MiR EFb2 var to identiske miR kassetter udtrykt i tandem, ene efter den anden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Evaluering af knockdown effektivitet og selektivitet af isoform-specifikke miRs for Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. Isoform-specifikke qRT-PCR analyse på RNA isoleret fra 17-18 DIV primære kulturer inficeret på 6 DIV med rAAVs udtrykker miRs målretning enten Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 og miR EFa3) eller Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Dataene er normaliseret til den negative kontrol (miR kontrol). miR EFa1 og miR EFa3 betydeligt og selektivt reducere mRNA Cav2.1 [EFa] (n = 8 og 7 kulturer, henholdsvis), mens miR EFb betydeligt og selektivt reducerer mRNA Cav2.1 [EFb] (n = 4 kulturer *** p < 0,001; envejs analyse af varians test efterfulgt af Tukey-Kramer post-test). Data præsenteres som betyder ± SEM. Dette tal er blevet tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. venligst klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. Vurdering af rollen som Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] i native hippocampus ved målrettet stimulation af bankede-nede neuroner med optogenetics. (A) ordningen af udtryk kassette af rAAV konstruktioner bruges til i vivo infektion. (B) hippocampus sektion viser at TdTomato Fluorescens er begrænset til regionen CA3 og sine fremskrivninger. (C) eksperimentelle konfiguration: laserstråle var rettet på CA3 somata og patch klemme optagelser blev udført fra CA1 pyramideformet neuroner. (D) 2 ms-lang blå (473 nm) lys laserpulser skinnede på 20 Hz fremmane EPSCs hvis PPF er steget med miRs målretning Cav2.1 [EFa] og afskaffet af miR for Cav2.1 [EFb]. (E) Resumé af parret puls ratio for eksperimenter som (D), viser en stigning i PPF for miR EFa1 og miR EFa3 og et fald til miR EFb2, relativ til miR kontrol (n = 9-11 optagelser; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0,0004; analyse af Kovarians). Data præsenteres som betyder ± SEM. Dette tal er blevet tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Co udtryk af en optogenetic sonde og en miR mod en præsynaptiske gen af interesse tilbyder en kraftfuld tilgang for at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. For denne eksperimentelle tilgang er det vigtigt at identificere og karakterisere miRs, der er meget effektive og selektiv i banke ned gen interesse for indfødte systemer. Hvis det er muligt, bør to eller flere uafhængige miRs mod den samme mRNA interesse anvendes til kontrol for eventuel off target effekter. Rescue eksperimenter, hvor et miR-resistente gen er genindført i systemet, kan bruges som en kontrol for specificitet.
Ved hjælp af den samme konstruktion til at udtrykke en optogenetic sonde og en miR giver mulighed for at stimulere optisk kun de præsynaptiske neuroner, der er blevet manipuleret. Det er ikke muligt med elektrisk stimulering, fordi de ikke skelner mellem inficerede og ikke-inficeret neuroner, dermed producere blandet og fortyndet resultater. Fordi optiske stimulering kan fremkalde flere handling potentialer15, er det vigtigt at vælge kun de hurtigste optogenetic sonder, blandt en ekspanderende palet15,19,20,21. Derudover er det vigtigt at sikre, at optisk stimulation ikke fremkalde en direkte depolarisering af præsynaptiske boutons, for at undgå at omgå nogle af trinene af synaptisk transmission man ønsker at undersøge22.
Den eksperimentelle tilgang vi beskrive her, gør det muligt at evaluere parallelt fysiologiske relevansen af flere præsynaptiske gener af interesse inden for en begrænset periode (4-6 måneder). Det er dog vigtigt at huske at knockdowns sjældent nå op på 100%. RAAVs skal desuden udtrykkes i mindst to uger til at give mulighed for maksimal knockdown og fulde udtryk af optogenetic sonde, som kan repræsentere en tidsmæssig begrænsning, når undersøger tidlige udviklingsprocesser. Selvom flere tidskrævende, betinget knockout mus begrænset til præsynaptiske neuroner resulterer generelt i fuldstændig fjernelse af gen af interesse og tilbyder derfor en gyldig komplementære tilgang.
En specifik fordel af miR-teknologi er, at det giver udtryk for flere miRs fra samme initiativtageren. Denne egenskab er primært blevet brugt til at øge knockdown effektivitet ved at indsætte flere kopier af den samme miR eller forskellige miRs mod det samme mål-gen. Det kan dog bruges også til knockdown flere gener ved at udtrykke miRs mod forskellige mål gener7,23. Denne egenskab kan bruges til at lukke munden på flere præsynaptiske proteiner for at dissekere præsynaptiske signaling veje.
Her, har vi kombineret optogenetics med kunstige miRs at karakterisere gen knockdown virkning på præsynaptiske funktion i akutte hippocampus skiver. En lignende fremgangsmåde kan også bruges til at manipulere og sonde neuronal kredsløb i vivo. Desuden vil kombinere kunstige miRs med chemogenetic tilgange aktivere en afhøre neuronal kredsløb på længere tidsskalaer.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) for støtte og Carmela Vitale for at hjælpe med demonstrationen. Dette arbejde blev finansieret af IIT og Compagnia San Paolo (grant no. 9734 til LAC).
Materials
| Acrylamide | Sigma | Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution | Toxic |
| Animal Temperature Controller with heat pad | WPI | ATC2000 | |
| BCA protein assay kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit | ThermoFisher Scientific | K4936-00 | |
| Brain slices Prechamber | Harvard Apparatus | BSC-PC | |
| CCD camera-based imager | Bio-Rad | ChemiDoc™ MP | |
| Cell Culture reagents | Life Technologies | ||
| Chemiluminescent substrate | GE Helthcare | ECL Western Blotting Reagents, RPN2106 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Toxic |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Sigma | C6645 | |
| Drill | Foredom | K.1030 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Gentamicin ointment | Local pharmacy | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Hepes | Sigma | 54459 | |
| Injection micropipettes | Narishige | GD1 | |
| Inorganic salts & detergents | Sigma | ||
| K2-creatine phosphate | Calbiochem | 237911 | |
| KGluconate | Fluka | 60245 | |
| Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-GFM-00100-03 | |
| Membrane | Amersham | Protran™ 0.2 µm NC | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| Micropipette holder | Narishige | IM-H1 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaPyruvate | Sigma | P5280 | |
| Ocular lubricant | Local pharmacy | Lacrigel | |
| Phosphate inhibitors | Sigma | P0044, P5726 | |
| Protease inhibitors | Sigma | cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | |
| Protein gel electrophoresis and blotting devices | Bio-Rad | Mini-Protean III Cell | |
| Providone iodine | Local pharmacy | Betadine | |
| Qiazol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Toxic |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit |
Qiagen | 205311 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Stereotactic apparatus | WPI | ||
| Tetrodotoxin | Tocris | 1069 | Toxic |
| Vibratome | Leica | VT1200S |
Referências
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).
- Maejima, T., et al. Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice. J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).
- Mark, M. D., et al. Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations. J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).
- Thalhammer, A., et al. Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity. Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Chung, K. H., et al. Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Cingolani, L. A., et al. Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins. Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).
- Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition. J Vis Exp. (92), e51845 (2014).
- Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), (2002).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Gunaydin, L. A., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Bourinet, E., et al. Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels. Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).
- Chaudhuri, D., et al. Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels. J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).
- Soong, T. W., et al. Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation. J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).
- Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
- Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer’s guide to potent multi-target RNAi. Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).
Citar este artigo
Thalhammer, A., Jaudon, F., Cingolani, L. A. Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits. J. Vis. Exp. (133), e57223, doi:10.3791/57223 (2018).