In vivo fiberkopplad preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE) av hippocampuskapillärer hos vakna möss
Summary
Medan multifotonavbildning endast är effektiv på begränsade djup från vävnadens yta, är det möjligt att uppnå 3 μm upplösning på vilket djup som helst via pCLE. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra pCLE-avbildning för att mäta mikrovaskulär dynamik i hippocampus hos iktal- och vildtypsmöss.
Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva fiberoptisk buntkopplad preklinisk konfokal laserskanningsendomikroskopi (pCLE) i dess specifika tillämpning för att belysa kapillära blodflödeseffekter under anfall, drivna av väggceller. In vitro och in vivo kortikal avbildning har visat att kapillärförträngningar som drivs av pericyter kan bero på funktionell lokal neural aktivitet, såväl som från läkemedelstillämpning, i friska djur. Här presenteras ett protokoll för hur man kan använda pCLE för att bestämma den mikrovaskulära dynamikens roll i neural degeneration vid epilepsi, på vilket vävnadsdjup som helst (specifikt i hippocampus). Vi beskriver en huvudstödsteknik som har anpassats för att registrera pCLE hos vakna djur, för att hantera potentiella biverkningar av anestesimedel på neural aktivitet. Med hjälp av dessa metoder kan elektrofysiologiska och avbildningsinspelningar utföras under flera timmar i djupa neurala strukturer i hjärnan.
Introduction
Till skillnad från andra mikroskopiska avbildningsmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8 möjliggör in vivo fiberoptisk konfokalmikroskopi mätning av blodflödesdynamik i vilken hjärnregion som helst, på vilket djup som helst, med hög hastighet (upp till 240 Hz beroende på synfältsstorlek9). En fiberoptisk sond möjliggör in vivo konfokal laserskanningsavbildning med 3 μm upplösning eftersom spetsen på sonden (ett linslöst objektiv som består av en bunt av 5000-6000 3 μm diameter enskilda fibrer) kan positioneras med en mikroelektrods noggrannhet, inom 15 μm från det fluorescerande målet av intresse. På samma sätt som vid in vivo-avbildning med två fotoner måste fluoroforer föras in i avbildningsmålet. Till exempel kan fluoresceindextran (eller kvantprickar) injiceras i kärlen, eller genetiskt kodade fluorescerande proteiner kan transfekteras in i celler, eller fluorescerande färgämnen som Oregon Green BAPTA-1 kan bulkladdas in i celler före avbildning.
Ny forskning med hjälp av dessa tekniker har visat att muralcellernas motoriska aktivitet som leder till iktala kapillära vasospasmer – plötsliga sammandragningar som uppstår vid väggcellernas position under anfall 9 – kan bidra till neurodegeneration i iktal hippocampus9. Medan tidigare avbildningsstudier visade in vitro och in vivo pericytsammandragningar kopplade till läkemedelsapplikationer 6,7,10,11,12, fann Leal-Campanario et al. de första bevisen på spontana kapillärsammandragningar in vivo i den murina hjärnan. För att fastställa relevans för human temporallobsepilepsi studerade de hanmöss (P30-40 gamla) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) möss 14,15 (JAX stock #003532), en genetisk modell av human episodisk ataxi typ 115. Pericyter drev både patologiska och fysiologiska hippocampus vasokonstriktioner9 hos de spontant epileptiska djuren och deras vilda kullsyskon. Dessa observationer replikerades i WT-djur som gjorts epileptiska med kainsyra, vilket indikerar deras generalisering till andra former av epilepsi. Leal-Campanario et al fastställde dessutom, med hjälp av nya stereologiska mikroskopimetoder, att apoptotiska – men inte friska – neuroner hos epileptiska djur var rumsligt kopplade till hippocampus mikrovaskulatur. Eftersom excitotoxicitet inte har någon känd rumslig koppling till kärlen, indikerade detta resultat att onormal kapillär vasospasmisk ischemi-inducerad hypoxi bidrar till neurodegeneration vid epilepsi. Figur 1 visar ett schema över den allmänna inställningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade ett fasthållningssystem för huvudmössor för samtidiga elektrofysiologiska och fiberoptiska pCLE-experiment i vakna möss, vilket minskar potentiell responskontaminering på grund av anestesiläkemedel. Huvudkåpan och monteringsapparaten är enkla att konstruera och kan återanvändas för avbildningsexperiment med kroniskt vaket beteende. Vi kontrollerade kvaliteten på inspelningarna mot guldstandarden för in vivo mikroskopisk blodflödesavbildning, TPLSM.
Skickliga kirurg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet finansierades av ett Research Initiative Award från American Epilepsy Society och ett pris från Arizona Biomedical Research Commission till S.L.M., samt ett utmaningsbidrag från Research to Prevent Blindness Inc. till avdelningen för oftalmologi vid SUNY Downstate Health Sciences University, New York State Empire Innovation Program, och ytterligare bidrag från National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614), Barrow Neurological Foundation, Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton, och Dignity Health SEED-utmärkelser, och genom federala bidrag från National Science Foundation (0726113, 0852636, & 1523614) och av National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), till S.L.M och S.M.C. Detta arbete stöddes också av Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs under utmärkelse nr. W81XWH-15-1-0138, till S.L.M. L.-C. fick stöd av ett José Castillejo-stipendium från det spanska utbildningsministeriet. Vi tackar O. Caballero och M. Ledo för deras tekniska råd och hjälp.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Referências
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neurociência. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
