In vivo fiberkoblet preklinisk konfokal laserskanning endomikroskopi (pCLE) av hippocampus-kapillærer hos våkne mus
Summary
Mens multifotonavbildning bare er effektiv på begrensede dybder fra vevets overflate, er det mulig å oppnå 3 μm oppløsningsavbildning på hvilken som helst dybde via pCLE. Her presenterer vi en protokoll for å gjennomføre pCLE-avbildning for å måle mikrovaskulær dynamikk i hippocampus hos iktale og villtypemus.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive fiberoptisk-bunt-koblet preklinisk konfokal laserskanning endomikroskopi (pCLE) i sin spesifikke anvendelse for å belyse kapillære blodstrømningseffekter under anfall, drevet av veggmalericeller. Kortikal avbildning in vitro og in vivo har vist at kapillærinnsnevringer drevet av pericytter kan skyldes funksjonell lokal nevral aktivitet, så vel som fra legemiddelanvendelse, hos friske dyr. Her presenteres en protokoll om hvordan man bruker pCLE for å bestemme rollen som mikrovaskulær dynamikk i nevral degenerasjon ved epilepsi, ved hvilken som helst vevsdybde (spesielt i hippocampus). Vi beskriver en hodestøtteteknikk som er tilpasset for å registrere pCLE hos våkne dyr, for å adressere potensielle bivirkninger av anestetika på nevral aktivitet. Ved hjelp av disse metodene kan elektrofysiologiske og bildebehandlingsopptak utføres over flere timer i dype nevrale strukturer i hjernen.
Introduction
I motsetning til andre mikroskopiske avbildningsmetoder 1,2,3,4,5,6,7,8, tillater in vivo fiberoptisk basert konfokalmikroskopi måling av blodstrømningsdynamikk i en hvilken som helst hjernegruppe, uansett dybde, ved høy hastighet (opptil 240 Hz avhengig av synsfelt størrelse9). En fiberoptisk sonde muliggjør in vivo konfokal laserskanningsavbildning ved 3 μm oppløsning fordi sondens spiss (et linseløst mål som består av et bunt på 5000-6000 3 μm diameter individuelle fibre) kan plasseres med en mikroelektrodes nøyaktighet, innenfor 15 μm av det fluorescerende målet av interesse. Som med in vivo to-foton avbildning, må fluoroforer tidligere innføres i avbildningsmålet. For eksempel kan fluorescein dextran (eller kvanteprikker) injiseres i vaskulaturen, eller genetisk kodede fluorescerende proteiner kan transfekteres til celler, eller fluorescerende fargestoffer som Oregon Green BAPTA-1 kan bulkbelastes i celler, før avbildning.
Nyere forskning ved hjelp av disse teknikkene har funnet at veggmalericellemotoraktivitet som fører til iktale kapillære vasospasmer – plutselige innsnevringer som oppstår ved veggmaleriets posisjon under anfall 9 – kan bidra til nevrodegenerasjon i iktal hippocampus9. Mens tidligere bildestudier in vitro og in vivo pericyttinnsnevringer knyttet til legemiddelapplikasjoner 6,7,10,11,12, fant Leal-Campanario et al. det første beviset på in vivo spontane kapillærinnsnevringer i murine hjernen. For å etablere relevans for human temporallappsepilepsi, studerte de mannlige (P30-40 gamle) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) mus 14,15 (JAX stock #003532), en genetisk modell av human episodisk ataksi type 115. Pericytter drev både patologiske og fysiologiske hippocampusveggmalerier vasokonstriksjoner9 hos spontant epileptiske dyr og deres villtype (WT) kullkamerater. Disse observasjonene ble replikert hos WT-dyr som ble epileptisk med kainsyre, og indikerte dermed generalisering til andre former for epilepsi. Leal-Campanario et al bestemte dessuten, ved hjelp av nye stereologiske mikroskopiske tilnærminger, at apoptotiske – men ikke sunne – nevroner i epileptiske dyr var romlig koblet til hippocampus-mikrovaskulaturen. Fordi eksitotoksisitet ikke har noen kjent romlig tilknytning til vaskulaturen, indikerte dette resultatet at unormal kapillær vasospasmisk iskemi-indusert hypoksi bidrar til nevrodegenerasjon ved epilepsi. Figur 1 viser et skjema over det generelle oppsettet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet et hodekappesikringssystem for samtidige elektrofysiologiske og fiberoptiske pCLE-eksperimenter i våkne mus, noe som reduserer potensiell responsforurensning på grunn av bedøvelsesmidler. Hodehetten og monteringsapparatet er enkle å konstruere og er gjenbrukbare for kroniske oppvåkningseksperimenter. Vi sjekket kvaliteten på opptakene opp mot gullstandarden for in vivo mikroskopisk blodstrømsavbildning, TPLSM.
Gode kirurgiske ferdigheter er nødvendig for å implementere pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Prosjektet ble finansiert av en forskningsinitiativpris fra American Epilepsy Society, og en pris fra Arizona Biomedical Research Commission til SLM, samt et utfordringsstipend fra Research to Prevent Blindness Inc. til Institutt for oftalmologi ved SUNY Downstate Health Sciences University, New York State Empire Innovation Program, og ytterligere tilskudd fra National Science Foundation (0726113, 0852636, &; 1523614), Barrow Neurological Foundation, fru Marian Rochelle, fru Grace Welton og Dignity Health SEED-priser, og ved føderale tilskudd fra National Science Foundation (0726113, 0852636, &; 1523614) og av National Institute of Health (Awards R01EY031971 AND R01CA258021), til SLM og SMC Dette arbeidet ble også støttet av kontoret til assisterende forsvarsminister for helsesaker under tildeling nr. W81XWH-15-1-0138, til SLM. L.-C. ble støttet av et José Castillejo-stipend fra det spanske utdanningsdepartementet. Vi takker O. Caballero og M. Ledo for deres tekniske råd og assistanse.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Referências
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neurociência. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
