Summary

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

이 프로토콜의 목표는 벽화 세포에 의해 구동되는 발작 중 모세관 혈류 효과를 설명하기 위한 특정 응용 분야에서 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)을 설명하는 것입니다. 시험관 내 및 생체 내 피질 영상은 pericyte에 의해 유발되는 모세혈관 수축이 건강한 동물의 기능적 국소 신경 활동뿐만 아니라 약물 적용으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서는 pCLE를 사용하여 모든 조직 깊이(특히 해마)에서 간질의 신경 퇴행에서 미세혈관 역학의 역할을 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 신경 활동에 대한 마취제의 잠재적인 부작용을 해결하기 위해 깨어 있는 동물의 pCLE를 기록하도록 조정된 머리 구속 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법을 사용하여 뇌의 심부 신경 구조에서 몇 시간에 걸쳐 전기 생리학 및 영상 기록을 수행할 수 있습니다.

Introduction

다른 현미경 이미징 방법(1,2,3,4,5,6,7,8)과 달리, 생체 내 광섬유 기반 컨포칼 현미경은 모든 뇌 영역, 모든 깊이에서 고속(시야 크기에 따라 최대 240Hz)으로 혈류 역학을 측정할 수 있습니다9). 광섬유 프로브는 프로브의 팁(5000-6000개의 3μm 직경의 개별 섬유 번들로 구성된 렌즈 없는 대물렌즈)이 관심 형광 대상의 15μm 이내에서 미세 전극의 정확도로 배치될 수 있기 때문에 3μm 해상도에서 생체 내 컨포칼 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 합니다. in vivo two-photon imaging과 마찬가지로, 형광단은 이미징 타겟에 미리 도입되어야 합니다. 예를 들어, 플루오레세인 덱스트란(또는 퀀텀닷)을 혈관 조직에 주입하거나, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 세포에 transfection하거나, Oregon Green BAPTA-1과 같은 형광 염료를 이미징 전에 세포에 벌크 로딩할 수 있습니다.

이러한 기법을 이용한 최근 연구에서는 발작 중 벽화 세포의 위치에서 발생하는 갑작스러운 수축인 외측 모세혈관 경련(ictal capillary vasospasm)9을 유발하는 벽체 세포 운동 활동이 전골 해마(ictal hippocampus)9의 신경 퇴화에 기여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이전의 이미징 연구는 약물 적용과 관련된 in vitro 및 in vivo pericyte constrictings를 보여주었지만 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al.은 쥐 뇌에서 생체 내 자발적 모세혈관 수축의 첫 번째 증거를 발견했습니다. 인간 측두엽 간질과의 관련성을 확립하기 위해, 그들은 인간 일시적 운동 실조증 유형 1 15의 유전 모델인 수컷(P30-40세) 녹아웃(KO) Kv1.1(kcna1-null) 마우스14,15(JAX stock #003532)를 연구했다. pericyte는 자발적 간질을 하는 동물과 야생형(WT) 새끼에서 병리학적 및 생리학적 해마 벽화 혈관 수축(vasopcontractions)9을 유도했다. 이러한 관찰은 카이닌산으로 간질에 걸린 WT 동물에서 복제되었으며, 따라서 다른 형태의 간질에 대한 일반화를 나타냅니다. Leal-Campanario 등은 또한 새로운 입체학적 현미경 접근 방식을 사용하여 간질 동물의 세포사멸(건강하지는 않음) 뉴런이 해마 미세혈관에 공간적으로 결합되어 있음을 확인했습니다. 흥분독성은 혈관구조와 공간적 연관성이 알려져 있지 않기 때문에, 이 결과는 비정상적인 모세혈관 혈관 경련성 허혈 유발 저산소증이 간질의 신경 퇴행에 기여한다는 것을 나타냈다. 그림 1은 일반 설정의 개략도를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 NIH Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals를 따릅니다. 모든 절차는 Barrow Neurological Institute의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 1. 개두술을 위한 입체 위치 지정 무게를 잰 다음 케타민-자일라진(100mg/kg–10mg/kg i.p.) 칵테일로 마우스를 마취합니다. 꼬리 및/또는 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 관찰하여 동물이 완전히 마취되었는…

Representative Results

우리는 발작의 결과로 발생하는 해마의 비정상적인 세포 주위 모세혈관 혈관 경련이 ictal 초점 9,13에서 세포 사멸에 기여하는 솔직한 저산소증을 유발할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 이러한 방법을 개발했습니다. 헤드 캡의 개발과 적절한 설치는 기록에 높은 안정성을 제공하여 ictal 및 interictal 기간 동안 야생형 및 간질성 각성…

Discussion

우리는 깨어 있는 쥐에서 전기생리학 및 광섬유 pCLE 실험을 동시에 수행할 수 있는 헤드 캡 구속 시스템을 개발하여 마취제로 인한 잠재적인 반응 오염을 줄였습니다. 헤드 캡과 장착 장치는 구성이 간단하며 만성 각성 행동 이미징 실험에 재사용할 수 있습니다. 생체 내 현미경 혈류 영상(TPLSM)의 황금 표준과 비교하여 기록의 품질을 확인했습니다.

여기에 설명된 프로토콜을 …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 미국 간질 학회(American Epilepsy Society)의 연구 이니셔티브 상(Research Initiative Award)과 애리조나 생물의학 연구 위원회(Arizona Biomedical Research Commission)의 S.L.M. 상, SUNY 다운스테이트 보건 과학 대학(SUNY Downstate Health Sciences University)의 안과에 대한 실명 예방 연구(Research to Prevent Blindness Inc.)의 챌린지 보조금, 뉴욕주 엠파이어 혁신 프로그램(New York State Empire Innovation Program)의 자금 지원을 받았습니다. 미국 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614), 배로우 신경학 재단(Barrow Neurological Foundation), 마리안 로셸(Marian Rochelle), 그레이스 웰튼(Grace Welton), 디그니티 헬스 시드(Dignity Health SEED) 상, 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614) 및 국립보건원(National Institute of Health, R01EY031971 및 R01CA258021)의 연방 보조금, S.L.M 및 S.M.C.이 작업은 또한 국방부 보건 담당 차관보실의 지원을 받았습니다. W81XWH-15-1-0138, S.L.M. L.-C.는 스페인 교육부의 José Castillejo 펠로우십의 지원을 받았습니다. 기술적 조언과 도움을 주신 O. Caballero와 M. Ledo에게 감사드립니다. 

Materials

0.7 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-07 For Screws No. 19010-00
0.9 mm diameter burr Fine Science Tools 19007-09
ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS from Handpiece solution AEU12C
Bull dog serrifine clump Fine Science Tools 18050-28
CellVizio dual band Mauna Kea Technologies
CellVizio single band Mauna Kea Technologies
Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) Mauna Kea Technologies
Custom-made alignment piece L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center
Custom-made mounting bar The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.
Cyanoacrylate adhesive-Super Glue
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11252-20
DuraLay Inlay Resin – Standard Package Reliance Dental Mfg Co. 602-7395 (from patterson dental)
Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw MSC industrial direct co. 2834117
Fine Point scissor Fine Science Tools 14090-09
Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) Invitrogen, USA D7137
Halsey smooth needle holder Fine Science Tools 12001-13
Kalt suture needle 3/8 curved Fine Science Tools 12050-03
lab standard stereotaxic, rat and mouse Stoelting Co. 51704 51670
Methocel 2% Omnivision GmbH PZN: 04682367 Eye ointment to prevent dryness.
Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse CWE Inc. 08-13000
PhysioTel F20-EET transmitters DSI 270-0124-001
Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT Stoelting Co.C13 51704
Sel-Tapping bone screws Fine Science Tools 19010-10
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic Stoelting Co 51648
Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 Fine Science Tools 18020-40
Tissue separating microspatula Fine Science Tools 10091-121

Referências

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Leal-Campanario, R., Martinez-Conde, S., Macknik, S. L. In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice. J. Vis. Exp. (194), e57220, doi:10.3791/57220 (2023).

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