覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)
Summary
多光子イメージングは組織表面からの限られた深さでしか効果がありませんが、pCLEを介して任意の深さで3μm分解能のイメージングを達成することが可能です。ここでは、発作性マウスと野生型マウスの海馬の微小血管動態を測定するためのpCLEイメージングを実施するためのプロトコルを提示します。
Abstract
このプロトコルの目的は、壁細胞によって駆動される発作時の毛細血管血流効果を解明するための特定のアプリケーションにおいて、光ファイバーバンドル結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡(pCLE)を記述することです。In vitroおよびin vivo皮質イメージングは、周皮細胞によって引き起こされる毛細血管収縮が、健康な動物の機能的な局所神経活動および薬物適用に起因する可能性があることを示しています。ここでは、pCLEを使用して、てんかんの神経変性における微小血管ダイナミクスの役割を、あらゆる組織の深さ(特に海馬)で決定する方法に関するプロトコルが示されています。本稿では、神経活動に対する麻酔薬の潜在的な副作用に対処するために、覚醒した動物のpCLEを記録するために適応された頭部拘束技術について説明する。これらの方法を用いることで、脳の深部神経構造において、電気生理学的および画像的記録を数時間にわたって行うことができる。
Introduction
他の顕微鏡イメージング法1,2,3,4,5,6,7,8とは対照的に、in vivo光ファイバーベースの共焦点顕微鏡は、任意の脳領域の血流動態を、任意の深さで、高速(視野サイズに応じて最大240Hz)で測定することができます9 ).光ファイバープローブは、プローブの先端(直径5000〜6000本の3μmの個々のファイバーの束で構成されるレンズレス対物レンズ)を微小電極の精度で目的の蛍光ターゲットから15μm以内に配置できるため、3μmの分解能でin vivo共焦点レーザー走査イメージングを可能にします。in vivo 2光子イメージングと同様に、蛍光色素はイメージングターゲットに事前に導入しておく必要があります。例えば、フルオレセインデキストラン(または量子ドット)を血管系に注入したり、遺伝子にコードされた蛍光タンパク質を細胞にトランスフェクションしたり、Oregon Green BAPTA-1などの蛍光色素をイメージング前に細胞にバルクロードしたりすることができます。
これらの技術を用いた最近の研究では、発作性毛細血管痙攣(発作中に壁細胞の位置に起こる突然の収縮)につながる壁画細胞の運動活動が、発作性海馬の神経変性に寄与する可能性があることがわかった9。以前のイメージング研究では、in vitroおよびin vivoの周皮細胞の狭窄が薬物用途に関連することが示されていましたが6,7,10,11,12、Leal-Campanarioらは、マウスの脳におけるin vivoの自発的な毛細血管収縮の最初の証拠を発見しました。ヒトの側頭葉てんかんとの関連性を確立するために、彼らは雄(P30-40歳)ノックアウト(KO)Kv1.1(kcna1-null)マウス14,15(JAXストック#003532)、ヒトエピソード性運動失調症1型の遺伝的モデルを研究しました15。周皮細胞は、自然発生的にてんかんを起こした動物とその野生型(WT)同腹仔において、病理学的および生理学的海馬壁画血管収縮9を引き起こした。これらの観察は、カイニン酸でてんかんを起こしたWT動物で再現され、それによって他の形態のてんかんへの一般化を示しています。.さらに、Leal-Campanarioらは、新しい立体顕微鏡法を用いて、てんかん動物のアポトーシスニューロン(健康ではない)が海馬の微小血管系に空間的に結合していることを突き止めました。興奮毒性は血管系との空間的関連性が知られていないため、この結果は、異常な毛細血管血管痙攣性虚血誘発性低酸素症がてんかんの神経変性に寄与していることを示しました。図1は、一般的なセットアップの概略図を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、覚醒マウスの電気生理学的実験と光ファイバーpCLE実験を同時に行うためのヘッドキャップ拘束システムを開発し、麻酔薬による潜在的な応答汚染を低減しました。ヘッドキャップと取り付け装置は簡単に組み立てることができ、慢性的な覚醒行動のイメージング実験に再利用できます。記録の品質を、in vivo顕微鏡血流イメージングのゴールドスタンダードであるTPLSMに照らして確認…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、米国てんかん学会のResearch Initiative Award、Arizona Biomedical Research CommissionからS.L.M.への賞、およびResearch to Prevent Blindness Inc.からSUNYダウンステート健康科学大学眼科へのチャレンジ助成金、New York State Empire Innovation Programによって資金提供されました。 全米科学財団(0726113、0852636、1523614)、バロー神経学財団、マリアン・ロシェル夫人、グレース・ウェルトン夫人、ディグニティ・ヘルス・シード賞、全米科学財団(0726113、0852636、1523614)および国立衛生研究所(R01EY031971およびR01CA258021)からの連邦助成金から、S.L.M.およびS.M.C.への助成金。この作業は、国防次官補室(保健問題担当)の助成金も受けています。W81XWH-15-1-0138、SLM へL.-C.は、スペイン教育省のホセ・カスティジェホ・フェローシップの支援を受けました。O. Caballero 氏と M. Ledo 氏の技術的なアドバイスと支援に感謝します。
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Referências
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903 (2001).
- Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).
- Larson, D. R., et al. Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo. Science. 300, 1434-1436 (2003).
- Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes. Glia. 46, 95-100 (2004).
- Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci. Neurociência. 128, 209-216 (2004).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biology. 4, 22 (2006).
- Leal-Campanario, R., et al. Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy. Scientific Reports. 7, 43276 (2017).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443, 700-704 (2006).
- Yemisci, M., et al. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).
- Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach. Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).
- Smart, S. L., et al. Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice. Neuron. 20, 809-819 (1998).
- Zuberi, S. M., et al. A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy. Brain. 122, 817-825 (1999).
