Identificación de células satélite del músculo esquelético por inmunofluorescencia con anticuerpos de laminina y Pax7
Summary
La identificación precisa de las células satélite es fundamental para el estudio de sus funciones bajo varias condiciones fisiológicas y patológicas. Este artículo presenta un protocolo para identificar las células satélite en secciones del músculo esquelético adulto por tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
La inmunofluorescencia es un método eficaz que ayuda a identificar los diferentes tipos de células en cortes de tejidos. Para estudiar la población de células deseada, anticuerpos para marcadores de células específicas se aplican en secciones de tejidos. En el músculo esquelético adulto, las células satélites (SCs) son células que contribuyen a la regeneración y reparación del músculo. Por lo tanto, es importante visualizar y localizar la población de células satélite en diferentes condiciones fisiológicas. En músculo esquelético en reposo, SCs residen entre la lámina basal y la membrana del plasma del myofiber. Un marcador utilizado para la identificación de SCs en la myofibers o en cultivo celular es la caja apareados proteína Pax7. En este artículo, se presenta un protocolo optimizado de inmunofluorescencia Pax7 en secciones del músculo esquelético que minimiza la tinción inespecífica y fondo. Otro anticuerpo que reconoce una proteína (laminina) de la lámina basal también se agregó ayudar a identificar protocolos SCs. Similar puede emplearse para realizar doble o triple de etiquetado con Pax7 y anticuerpos para proteínas adicionales de interés.
Introduction
Músculo esquelético está compuesto por células multinucleadas musculares, llamado miotubos, organizado en myofibers, que generan fuerza y movimientos a través de la contracción. Más los músculos esqueléticos, excepto algunos músculos craneofaciales, se derivan de una estructura embrionaria temporal llamada un somite1. Células precursoras miógenas delaminate de la somite epitelial para convertirse en mioblastos. Mioblastos: más se diferencia en miocitos que se fusionan para convertirse en miotubos para formar myofibers multi-nucleated. El proceso anterior se llama miogénesis y se caracteriza por el control temporal regulado de la expresión génica. Precursores miogénicos expresan Pax3 y Pax7, mientras que los mioblastos expresan MyoD y Myf5 y miocitos expresan myogenin y miosinas2,3. Crecimiento muscular es un proceso en el cual myofibers ser más grandes por incorporar más petequiales existentes fibras (hiperplasia) y un aumento en la fibra muscular (hipertrofia) de tamaño4. Durante el crecimiento muscular, hay una fuente sostenible de células miógenas que tienen propiedades de células madre que pueden diferenciarse y autorrenovación. Estas células se denominan células satélite basadas en su ubicación física entre el sarcolema (membrana de la célula de la myofiber) y la lámina basal5. SCs vigorosamente contribuyen al crecimiento del músculo en la etapa juvenil (las primeras 2-3 semanas de postnatales ratones), pero convertido en reposo en reposo muscular adulto6. Notable, puede ser reactivadas en respuesta al músculo de lesiones y se diferencian en nuevas células del músculo para reparar el músculo dañado7.
Las propiedades de la célula de vástago hacen el estudio de SCs relevantes para la biología básica del músculo y terapias musculares enfermedades8. Como resultado, ha sido un área de intensa investigación en las últimas décadas. Una enormes progresos en la genética y epigenética del SCs9,10de disección. Técnicas de aislamiento e identificación de SCs en situ fueron desarrolladas y optimizadas a lo largo de la manera11. Tinción inmunofluorescente permite la identificación de SCs mediante el uso de anticuerpos específicos, incluyendo para Pax7. Sin embargo, la escasez y el tamaño pequeño del SCs combinado con una fuerte auto-fluorescencia del tejido músculo esquelético adulto hacen que la visualización desafiante. Aquí, describimos un protocolo de tinción inmunofluorescente optimizado para el tejido de músculo de ratón para Pax7 y basado en un método existente para músculo de pez cebra12. Además, se emplea un anticuerpo de laminina marcado con un fluoróforo distinto para identificar la lámina basal que el SCs se encuentran. Constantemente, este protocolo permite la visualización de SCs Pax7-positivo y precursores miogénicos bajo condiciones fisiológicas todo probadas y etapas de desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo anterior se basó en un método de tinción MF20/Pax7 en pez cebra músculo esquelético12. Las soluciones utilizan y el bloqueo de pasos son idénticos o similares. Los anticuerpos utilizados son idénticos. Los pasos ajustados se basaron en las características del tejido de músculo de ratón y SCs. En primer lugar, laminina anticuerpo fue agregado en la mezcla para ayudar a visualizar y confirmar la posición del SCs. Fue especialmente útil contar el número de CS al microscopio …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la sección de proyección de imagen de luz de NIAMS para proporcionar la ayuda técnica y microscopios. Los anticuerpos MF20 y Pax7 se obtuvieron de estudios hibridoma Banco desarrollo desarrollado bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por el Departamento de ciencias biológicas, la Universidad de Iowa, Iowa City. Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación intramuros de NIAMS de los institutos nacionales de salud.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referências
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
