Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител
Summary
Точное определение спутниковой клеток имеет существенно важное значение для изучения их функции в различных физиологических и патологических условиях. Эта статья представляет протокол для идентификации Спутниковое клетки на участках взрослых скелетных мышц путем на основе иммунофлюоресценции пятнать.
Abstract
Иммунофлюоресценции является эффективным методом, который помогает определить различных типов клеток на разделах ткани. С целью изучения населения нужной ячейки, антитела для конкретной ячейки маркеры применяются на разделах ткани. В взрослых скелетных мышц Спутниковое клетки (SCs) являются стволовые клетки, которые способствуют ремонта мышц и регенерации. Таким образом важно визуализировать и отслеживать популяции Спутниковое клеток при различных физиологических условиях. В отдыхая скелетных мышц, СКС находятся между базальной пластинки и myofiber плазматической мембраны. Маркер обычно используется для выявления СКС на myofibers или в культуре клеток — парные поле белок Pax7. В этой статье оптимизированный протокол иммунофлюоресценции Pax7 на скелетных мышц секции представлены который минимизирует неспецифичный пятнать и фона. Другой антитела которое узнает белок (Ламинин) базальной пластинки была также добавлена, чтобы помочь определить SCs. аналогичные протоколы также может использоваться для выполнения двойной или тройной маркировки с Pax7 и антител для дополнительных протеинов интереса.
Introduction
Скелетных мышц состоит из многоядерные мышечных клеток, называется myotubes, организованных в myofibers, которые генерируют силы и движения через сокращение. Наиболее скелетных мышц, за исключением некоторых черепно-лицевых мышц, являются производными от временного эмбриональных структура под названием Сомит1. Клетки-предшественники миогенных расслаиваться из эпителиальных Сомит стать сомитов. Сомитов далее дифференцироваться в миоциты, что предохранитель стать myotubes в форме многосторонних ядерных myofibers. Описанный выше процесс называется ультраструктур и характеризуется височно регулируемой контроля экспрессии генов. Миогенных прекурсоров Экспресс, Pax3 и Pax7, тогда как сомитов Экспресс мёд и/или Myf5 и миоцитов Экспресс2,myogenin и myosins3. Рост мышц — это процесс, в котором myofibers становится больше, путем включения более myonuclei в существующих волокна (гиперплазия) и увеличение мышечного волокна размер (гипертрофия)4. Во время роста мышц является устойчивым источником миогенных клетки, которые имеют свойства стволовых клеток в том, что они могут различать и самостоятельного обновления. Эти клетки называются Спутниковое ячейки, основанные на их физическое местоположение между сарколеммы (клеточной мембраны myofiber) и базальной пластинки5. СКС энергично способствовать росту мышц в ювенильной стадии (первые 2-3 недель послеродового мышей), но стать покоя в отдыха взрослых мышцы6. Удивительно, они могут быть повторно активирована в ответ на мышцы ранит и дифференцироваться в новых мышечных клеток для восстановления поврежденных мышц7.
Стволовых клеток свойства делают исследование СКС для биологии основные мышцы и терапии заболеваний мышц8. В результате он был области интенсивного расследования в течение последних десятилетий. Огромный прогресс был достигнут в рассекает генетики и эпигенетики СКС9,10. Участвующих в изоляции и выявления СКС в situ методы были разработаны и оптимизированы вдоль пути11. Immunofluorescent окрашивание позволяет идентифицировать СКС с помощью специфических антител, в том числе для Pax7. Однако нехватка и малый размер СКС, в сочетании с сильным auto флуоресценции взрослых скелетной мышечной ткани отображения визуализации сложных. Здесь мы описываем immunofluorescent окрашивание протокол оптимизирован для мыши мышечной ткани для Pax7 и на основе существующего метода для данио рерио мышцы12. Кроме того Ламинин антитело обозначено с различных Флюорофор используется для идентификации базальной пластинки, под которой расположены ГКС. Этот протокол позволяет последовательно визуализации Pax7-позитивных СКС и миогенных прекурсоров всех протестированных физиологических условиях и стадии развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вышеупомянутый Протокол основан на методе Pax7/MF20 окрашивания данио рерио скелетных мышц12. Решения используется и преграждать шаги являются идентичными или однородными. Антитела, которые используются идентичны. Скорректированные шаги были основаны на функции мыши мышечно…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим NIAMS свет Imaging секцию для микроскопов и техническая помощь. MF20 и Pax7 антитела были получены от развития банка гибридомной исследований разрабатывается под эгидой NICHD и поддерживается Департаментом биологических наук, Университет штата Айова, Айова-Сити. Эта работа была поддержана интрамуральных исследовательской программы NIAMS национальных институтов здоровья.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referências
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
