Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones
Summary
Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.
Abstract
Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.
Introduction
Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos1. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M31. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.
Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren2 y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello3. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival4, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío5y colección mediante tubos capilares de cristal6 o una micropipeta7,8, 9. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.
Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.
El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referências
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