Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees
Summary
Het doel van het protocol is het bouwen van een inflammatoire menselijke tandvlees model in vitro. Dit weefsel model cultiveert samen drie soorten menselijke cellen, HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, driedimensionale omstandigheden. Dit model kan worden toegepast op het onderzoek naar parodontale ziekten, zoals gingivitis en Parodontitis.
Abstract
Parodontale ziekten (zoals gingivitis en parodontitis) zijn de belangrijkste oorzaken van tandverlies bij volwassenen. Ontsteking in tandvlees is de fundamentele fysiopathologie van parodontale ziekten. Huidige experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de wederopbouw van menselijk weefsel van de inflammatoire equivalenten van tandvlees (iGTE) in vitro. Wij bouwen eerst menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) door gebruik te maken van twee soorten menselijke cellen, met inbegrip van menselijke gingival fibroblasten (HGF) en menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT), drie-dimensionale omstandigheden. We maken een wond-model met behulp van een weefsel perforatie om punch een gat in de GTE. Volgende, menselijke THP-1 monocyten gemengd met collageen gel worden ingespoten in het gat in de GTE. Door adimistration van 10 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voor 72 uur, THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen naar formulier inflammatoire foci in GTE (iGTE) (IGTE kunnen ook stumilated met 2 µg/mL lipopolysacchariden (LPS) voor 48 h tot ontsteking ). IGTE is de eerste in vitro model van inflammatoire tandvlees met behulp van menselijke cellen met een driedimensionale architectuur. IGTE weerspiegelt belangrijke pathologische veranderingen (immunocytes werkzaamheden, intracellulaire interacties tussen fibryoblasts, epitheliaale cellen, monocyten en macrofagen) in parodontale ziekten. GTE, gewonde GTE en iGTE kunnen worden gebruikt als veelzijdige tools om te studeren wondgenezing, weefselregeneratie, ontsteking, cel-cel interactie en scherm potentiële geneesmiddelen voor parodontale ziekten.
Introduction
Parodontale ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van tandverlies bij volwassenen. Gingivitis en Parodontitis zijn de meest voorkomende parodontale ziekten. Beide aanwezig biofilm-gemedieerde acute of chronische ontstekingsreactie in het tandvlees. Gingivitis wordt gekenmerkt door een acute ontsteking, overwegende dat parodontitis meestal als chronische ontsteking presenteert. Op het niveau van de histologische activeren bacteriële onderdelen de activering van immune cellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen mestcellen1,2. Deze immune cellen, met name in macrofagen, interactie met lokale cellen (inclusief gingival epitheliale cellen, fibroblasten, endotheliale cellen en botcellen) wat resulteert in de inflammatoire letsels in parodontale weefsel3,4. Experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren, zoals ratten, hamsters, konijnen, fretten, hoektanden en primaten. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten5. Co teelt van Parodontale bacteriën en enkelgelaagde menselijke mondelinge epitheliale cellen is gebruikt om het mechanisme van parodontale infecties6onderzoeken. Niettemin ontbreken enkelgelaagde culturen van mondelinge cellen de driedimensionale (3D) cellulaire architectuur van intact weefsel; Daarom, zij kunnen niet na te bootsen de situatie in vitro .
3D inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (iGTE) zijn hier gevestigd parodontale ziekten in vitrote vertegenwoordigen. Deze 3D-model van parodontale ziekten is gevestigd in een tussenpositie tussen enkelgelaagde cel-culturen en dierlijke modellen. Drie soorten menselijke cellen, met inbegrip van HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, zijn samen op collageen gel worden gekweekt, en gestimuleerd door inflammatoire initiatiefnemers te bouwen iGTE. IGTE simuleert nauw de in vivo voorwaarden van celdifferentiatie, interactie van cel-cel en macrofaag activering in het tandvlees. Dit model heeft vele mogelijke toepassingen voor drug screening en testen van nieuwe farmacologische benaderingen in parodontale ziekten, alsmede voor het analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen in de wondgenezing, ontsteking en weefselregeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op de methoden van het creëren van gingival weefsel equivalenten en onderhuids vetweefsel equivalenten beschreven door vorige verslagen8,–21,22. Hoewel dit een eenvoudige en gemakkelijke methode is, vereist enkele stappen speciale aandacht. Het mengsel van collageen moet bijvoorbeeld op ijs worden bewaard tot gebruik om te voorkomen dat de formatie van de gel in de oplossing. Bij het toevoegen van het …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (26861689 en 17 K 11813). De auteurs bedank Mr. Nathaniel Green voor proeflezen.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
Referências
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
