DNA 染色、シアニン色素が消化される制限の酵素とかどうかを決定します。
Summary
蛍光顕微鏡用 dna を染色科学者実験中にそれらを表示することができます。今回紹介した方法で DNA 分子は事前に蛍光染料で染色された、メチル化および非メチル化敏感な制限の酵素と消化されます。
Abstract
蛍光顕微鏡用 DNA の可視化は、さまざまなシアニン色素などの色素を利用しています。これらの染料は、DNA の彼らの親和性が高いと感度のため利用されます。DNA 分子実験の完了の後の完全な長さをかを決定するためには、ステンド グラスの分子が DNA の制限の酵素と消化によって完全な長さをあるかどうかをメソッドが必要です。しかし、ステンド グラスの DNA は酵素が阻害する可能性があるため、螢光色素の 1 つ使用できるどのような酵素は、DNA を染色する方法が必要です。このメソッドでは、DNA は染料と平衡に DNA を許可する一晩シアニン系感光色素と汚れます。次に、ステンド グラスの DNA は制限の酵素と消化され、ゲルに読み込まれ、electrophoresed。実験的 DNA ダイジェスト バンドは、制限酵素活性を決定するインシリコダイジェストと比較されます。期待どおりに、バンドの同じ数がある、反作用は完了です。部分消化を示す予想よりもより多くのバンドおよびより少ないバンド不完全な消化力を示します。この方法の利点は、そのシンプルさと科学者が制限の酵素の必要な機器を使用して試金およびゲルの電気泳動。このメソッドの制限はほとんどの科学者に利用可能な酵素が市販の酵素;ただし、任意の制限酵素を使用可能性があります。
Introduction
トト シリーズ (TOTO 1 ヨーヨー 1 ポポ 1、ボボ 1、トト 3、ヨーヨー 3、ポ-3、ボボ-3;表 1)さまざまな DNA の可視化が必要な1,2,3,4,5,6,7、の実験に利用されています。8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. シアニン ダイマー家族はその量子収率、感度、および DNA 分子18,19,20の親和性が高いため広く使用されています。シアニン ダイマー色素蛍光21の 100 〜 1000 倍の増加を持っている偉大な選択インターカ レートしたとき、二本鎖 DNA があります。ピリジニウム染料 (ヨーヨー 1、TOTO 1、ヨーヨー-3、およびトト 3)、quinolium (ボボ 1、ポポ 1、ボボ-3、およびポポ 3) (表 1) のカウンター パート22よりも短い波長があります。また、DNA にインターカ レートしたシアニン ダイマー量子収率は高い (0.2 – 0.6)22。ただし、既に蛍光染料で染色、DNA の分子の23を拡大または DNA 分子2のメチル化プロファイルを決定する酵素を使用すると、どのような酵素はステンド グラスの DNA を消化を判断する方法が必要です。DNA に主体の染料の任意の型、または DNA 基板の識別可能なパターンを提供する酵素は、このメソッドを使用できます。
孟らはまず、さまざまな異なる染料24を使用してゲルの電気泳動による prestained DNA の消化率を決定します。Maschmannらに掘り下げたを染料のトト家族見て深い。両方には、DNA の特定の色素で染色でした25の制限の酵素と消化されるかどうかを参照してくださいに汚された DNA の消化率が決定されます。他の方法は、光ピンセット26または27NMR を用いた DNA にインターカ レートした色素の結合効果を検討します。どちらの方法でも特殊な装置が必要です。このメソッドを使用する場合は染料を判断しなければならないほとんどの分子生物学実験室機器に対し、制限酵素消化を妨げます。
また、任意の分子の長さを測定する他の方法で光マッピングは表面に無染色の dna を伸長、ストレッチとフラグメントのサイズを決定する DNA を消化します。輪郭の長さが異なる21染料のインターカレーションは DNA 分子の蛍光染色の使用染料によって輪郭の長さを増加する示されています。このメソッドは様々 なゲノム1,3,4,6,13,28,29,30,に利用されています。31します。 ただし、分子の色素と酵素によって、あらかじめ染色なら、酵素できないことがあります特定の色素に染まった DNA を切断します。したがって、このメソッドは、特定の色素に染まった DNA 酵素と消化できないかどうかを決定します。さらに、染料と染料の利用、DNA の移動度の濃度に応じてゲルのバンド移行されます32 の塩基対の間に挿入するための染料のための部屋を作る DNA のバックボーンの部分的なアンワインドのためネイティブ DNA よりもゆっくりと.
しかし、時々 これらの染料を部分的または完全にある特定の制限の酵素7,24の作用を抑制します。これは蛍光染料、酵素を特定の順序を認識できない場合がありますの添付ファイルによって引き起こされる DNA の構造変化が原因であると考えられます。これらの染料が制限の酵素にどのような影響を与えるかを理解することは、実験でメチル化プロファイルまたは汚された DNA のストレッチが必要です助けることができます。
手法では, DNA は興味の螢光色素で染色され制限の酵素と消化されます。DNA がゲル、イメージの electrophoresed だったし、制限の酵素の消化率を測定しました。制限酵素は、ゲルの切断面パターンに基づいて選ばれました。バンドが多すぎる原因 DNA バンドの重なりとあまりにもいくつかのバンドは DNA の分子の完全な画像を与えていません。消化の DNA 分子のプロファイルを決定することができるにスイート スポットがあります。したがって、それは使用される DNA や酵素に依存されます。この方法の利点はその単純さです。それだけ制限消化とゲルの電気泳動で使用する機器が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光に分類された DNA (図 1)を消化するために一連の手順が必要です。最初に、DNA は染色、螢光色素の一夜。DNA は、時間の短い期間のためシアニン ダイマーで培養できます。しかし、カールソンらは DNA が不完全な染色20による DNA サイズごとに二重のバンドを作成することを発見しました。この問題を解決するため、DNA は二重バン?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は国立研究所の一般的な医療科学 (日の出) (5605100122001)、ネブラスカ大学カーニー (UNK) 夏学生研究プログラム (SSRP) と UNK と同様、国民衛生の健康 (NIH)、コンポーネントによって資金を供給学部研究員 (ウルフ)。
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
Referências
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Bioquímica. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
