קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה
Summary
צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.
Abstract
ויזואליזציה של ה-DNA על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מנצל במגוון צבעים כגון צבעי cyanine. צבעים אלה מנוצלים בשל שלהם זיקה גבוהה ורגישות לדנ א. על מנת לקבוע אם מולקולות DNA הן באורך מלא לאחר סיום הניסוי, שיטה נדרשת כדי לקבוע אם מולקולות מוכתמים הם באורך מלא על ידי ה-DNA עם אנזימי הגבלה. עם זאת, DNA מוכתם עלול לעכב האנזימים, כך שיטה נדרשת כדי לקבוע איזה אנזימים אחד תוכל להשתמש עבור fluorochrome צבעונית הדנ א. בשיטה זו, ה-DNA הוא מוכתם צבע cyanine בין לילה כדי לאפשר את צבען ואת ה-DNA כדי equilibrate. דנ א הבא, ויטראז’ים מתעכל עם אנזים ההגבלה, נטען לתוך ג’ל, electrophoresed. הלהקות תקציר DNA ניסיוני מושווים לעיכול סיליקו כדי לקבוע את פעילות אנזים הגבלה. אם יש מספר זהה של להקות, כצפוי, ואז התגובה היא מלאה. עוד להקות מהצפוי מצביעים על עיכול חלקי ולהקות פחות מצביעים על עיכול לא שלם. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות שלה, היא משתמשת בציוד מדען צריכה בשביל באנזים הגבלה assay, ג’ל אלקטרופורזה. מגבלה של שיטה זו הוא זמין למדענים רוב האנזימים הם אנזימים זמינים מסחרית; עם זאת, אפשר להשתמש אנזימי הגבלה כלשהי.
Introduction
הסדרה טוטו (טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3 ובובו-3; טבלה 1) הוא מנוצל במגוון רחב של ניסויים איפה הפריט החזותי של ה-DNA נדרש1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. משפחת דימר cyanine נעשה שימוש נרחב שלהם תשואה קוונטית, רגישות וכתוצאה זיקה גבוהה עבור ה-DNA מולקולות18,19,20. צבעי דימר cyanine יש סלקטיביות נהדר עבור DNA נטושים כפול, כאשר intercalated יש עלייה 100 עד 1000 קיפול של קרינה פלואורסצנטית21. Pyridinium צבענים (YOYO-1, טוטו-1, YOYO-3 וטוטו-3) יש פליטה אורך גל קצר יותר מאשר שלהם quinolium לצבוע את עמיתיהם (טבלה 1) (בובו-1, פופו-1, בובו-3 ו- 3 פופו)22. כמו כן, התשואה קוונטית של הדימרים cyanine intercalated לתוך ה-DNA הוא גבוה (0.2 – 0.6)22. עם זאת, באמצעות אנזים כדי לקבוע את הפרופיל מתילציה של מולקולת ה-DNA2 או למתוח23 של מולקולה DNA כבר מוכתם הפלורסנט דורש שיטה לקביעת אנזימים מה לעכל DNA מוכתם. ניתן להשתמש בכל סוג של צבע זה intercalates לתוך ה-DNA או כל אנזים זה נותן דפוס ניכרת של המצע DNA עבור שיטה זו.
מנג. et al. קודם נקבע שיעור עיכול של DNA prestained באמצעות אלקטרופורזה בג’ל באמצעות מגוון של צבעים שונים24. . Maschmann et al. צלל ב עמוק יותר להסתכל על משפחת טוטו של צבע. שניהם נקבע שיעור עיכול של ויטראז’ים דנ א כדי לראות אם ה-DNA צבעונית עם צבע נתון יכול ובינינו עם אנזים הגבלה25. שיטות אחרות ללמוד איגוד אפקטים של צבעים intercalated עם ה-DNA בעזרת מלקחיים אופטיים26 או NMR27. אחת מהשיטות דורש ציוד מיוחד; ואילו, שיטה זו מאפשרת ציוד שיש רוב מעבדות ביולוגיה מולקולרית כדי לקבוע אם צבע מפריע לעיכול אנזים הגבלה.
בנוסף, בשיטות אחרות כדי למדוד את האורך של מולקולה נתונה, מיפוי אופטי מאורך, מוכתם במולקולות דנ א על משטח, מתעכל דנ א כדי לקבוע את המתיחה והגודל של קטעים. העיבור של צבע הוכח להגדיל את אורך מתאר של מולקולות DNA fluorescently ויטראז’ים ובהתאם את הצבע המשמש, אורך מתאר שונה21. בשיטה זו יש כבר מנוצל במגוון של הגנום1,3,4,6,13,28,29,30, 31. אולם, אם המולקולות היה מוכתם מראש, בהתאם לצבוע אנזים, האנזים לא יוכלו לגזור DNA צבעונית עם צבע נתון. לכן, בשיטה זו קובעת אם הדנ א צבעונית עם צבע נתון יכול להיות מתעכל עם אנזים. בנוסף, בהתאם לריכוז לצבוע, לצבוע מנוצל, הניידות של ה-DNA להקות בג’ל להעביר לאט יותר מאשר DNA יליד בשל ההתרה חלקית של עמוד השדרה ה-DNA כדי לפנות מקום לצבוע להוסיף בין בסיסי זוגות32 .
עם זאת, לפעמים אלה צבעי יכול חלקית או לחלוטין לעכב את הפעולה של אנזימי הגבלה מסוימת,7,24. זה נחשב להיות עקב שינוי מבני ב- DNA הנגרם על ידי ההחזקה של הפלורסנט, אשר עשוי למנוע את האנזים מהכרה רצף מסוים שלו. הבנה כיצד צבע אלה משפיעים על אנזימי הגבלה יכול לסייע בניסויים שבו נדרשת לפרופיל מתילציה או את המתיחה של DNA מוכתם.
בשיטה שלנו, ה-DNA היה מוכתם fluorochrome עניין, מתעכל עם אנזים ההגבלה. אז הדנ א היה electrophoresed-ג’ל, עם תמונה, נמדד קצב העיכול אנזים הגבלה. אנזימי הגבלה נבחרה בהתבסס על התבנית שנגזרו על ג’ל. מדי להקות גרם החפיפה של להקות DNA ולא מעט מדי להקות נתנו תמונה שלמה של ה-dna. יש חניה טובה. כדי להיות מסוגל לקבוע את הפרופיל של מולקולת הדנ א מתעכל; לכן, זה יהיה תלוי על ה-DNA בשימוש ואת האנזים. היתרון בשיטה זו הוא הפשטות שלה; זה רק דורש ציוד בשימוש של הגבלת לעיכול, ג’ל אלקטרופורזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
על מנת לעכל DNA fluorescently שכותרתו (איור 1), סדרה של צעדים נדרשים. ראשית, ה-DNA היא מוכתמת עם fluorochrome בן לילה. דנ א יכול להיות מודגרות עם cyanine הדימרים לתקופה קצרה של זמן; אולם, Carlsson. et al. נמצא כי ה-DNA נוצר להקות כפול עבור כל גודל ה-DNA עקב מכתימים לא שלם20. כדי לתקן ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5605100122001), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), כמו גם אוניברסיטת נברסקה קירני (UNK) קיץ תלמיד מחקר התוכנית (SSRP), ו UNK מלגת מחקר לתואר ראשון (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
Referências
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Bioquímica. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
