Fettsyra 13C Isotopologue profilering ger inblick i trofiska Carbon överföring och lipidmetabolismen ryggradslösa konsumenternas
Summary
Fettsyra trofiska markör metoden, dvs assimilering av fettsyror som hela molekylen och överföring i mjukpapper för konsumenter med ingen eller mindre modifiering, hämmas av kunskapsluckor fettsyra metabolismen av små jord ryggradslösa djur. Isotopologue profilering tillhandahålls som ett värdefullt verktyg att särskilja trofiska interaktioner.
Abstract
Fettsyror (FAs) är användbara biomarkörer i näringsväven ekologi eftersom de vanligtvis jämställs som en komplett molekyl och överförs till konsumenten vävnad med mindre eller ingen modifiering, vilket gör att kosten routning mellan olika trofiska nivåer. Metoden FA trofiska markör hämmas dock fortfarande av den begränsade kunskapen i lipidmetabolismen jord faunan. Denna studie använde helt märkta palmitinsyra (13C16:0, 99 atom %) som spårämne i fettsyra metabolism vägar av två utbredd jord Collembola, Protaphorura fimata och Heteromurus nitidus. För att undersöka de öde och metabola ändringar av denna föregångare, presenteras en metod för isotopologue profilering, framförd av masspektrometri med enda ion för övervakning. Dessutom beskrivs uppströms laboratoriet utfodring experiment, samt utvinning och metylering av dominerande lipid bråk (neutrala lipider, fosfolipider) och relaterade formel och beräkningar. Isotopologue profilering inte bara avkastningen totalt 13C anrikningen i fettsyror härrör från de 13C märkt föregångare men producerar också mönstret av kulturen som överstiger massan av överordnade jonen (dvs FA molekylära jonen M+) av varje märkt FA av en eller flera massenheter (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Denna kunskap kan slutsatser på förhållandet mellan dietary routning av en helt förbrukade FA i jämförelse med de novo biosyntes. Isotopologue profilering föreslås som ett användbart verktyg för utvärdering av fettsyra metabolism i markens djur att särskilja trofiska interaktioner.
Introduction
I en kryptisk livsmiljö som jord, trofiska relationer är svåra att adress och begränsas ytterligare av den lilla storleken på fauna. Det senaste decenniet har sett framsteg i biokemiska ekologi, bestämt i bruket av fettsyror som biomarkörer för att definiera utfodring strategier jord faunan under fältet villkor1,2,3. Detta är baserat på det faktum att fettsyror från resurser kan införlivas i mjukpapper för konsumenter som hela molekyler, en process som kallas kosten routing4. Överföring av fettsyror har rapporterats över tre trofinivåer, dvs från svampar att nematoder till Collembola5. Nyligen, den rovgiriga faunan ansågs6,7 och de första recensionerna på fettsyror som trofiska markörer i jord näringsvävar har varit publicerade8,9.
Mer detaljerad information om trofiska interaktioner uppnås genom fettsyra stabil isotop sondering (FA-SIP). Bestämning av 13C /12C nyckeltal i fettsyror i kostvanor och konsumenterna kan tillskriva binära länkar och uppskatta tillhörande kol flödet, och har varit anställd i terrestrial, färskvatten och Marina näringsvävar10,11 ,12,13. Det grundläggande antagandet är att kosten routade fettsyror inte omfattas av enzymatiska processer; Därför, deras 13C signal, dvs 13C /12C förhållandet av fettsyran, i konsumenten är liknande den i kost1. En successiv utarmning av 13C undertecknandet upp i näringskedjan har dock rapporterats i akvatiska system, därmed hindra breda tillämpning av FA-SIP i trofiska studier14,15,16. Dessutom är kunskap i lipidmetabolism i de flesta ryggradslösa djur i landlevande födovävar fortfarande begränsad.
En förståelse av lipid metabolism vägar i konsumenterna är väsentliga för användningen av trofiska markör fettsyror som hjälpmedel för fastställande av kvantitativa kol flödet i näringsväven ekologi. Med detta i åtanke, 13C-isotopologue profilering, som i princip kan tillämpas för utredning av kol metabolismen av alla biologiska system17, är en lovande metod. Efter införandet av ett 13C-märkta kol substrat, fördelningen av de 13C i metabola nätverket är spårbar sedan de genererade metaboliska produkterna i konsumenten visar en specifik isotopologue fördelning. Detta kan bedömas genom kvantitativa nukleära metabola resonans spektroskopi18,19 eller masspektrometri20,21, med sistnämnda gynnade i biologiska prover med låg biomassa på grund av dess högre känslighet.
Även om isotopologue profilering har framgångsrikt tillämpats till aminosyror och tillhandahålls insikt i vivo kol metabolismen av bakteriella patogener17,22,23, dess genomförande i fettsyror syror har släpat efter. Den första detaljerade analysen på ödet för en stabil isotop märkt föregångare fettsyra, dess kosten routning eller nedbrytning via β-oxidation, jord ryggradslösa konsumenter, utfördes nyligen av Menzel o.a. 24. här, metodologiska grunderna för inkorporeringen experiment med 13C märkta fettsyror följt av isotopologue analys av viktiga ättlingar i täta jord ryggradslösa djur, Collembola, tillhandahålls. Dessa microarthropods är en bra modellgrupp eftersom de utgör viktiga komponenter i markens näringsväv och är väl undersökt för deras trofiska markör fettsyror8,25.
En förståelse av lipid metabolism vägar i konsumenterna är väsentliga för användningen av trofiska markör fettsyror som hjälpmedel för fastställande av kvantitativa kol flödet i näringsväven ekologi. Detta protokoll ger design och ställ för ett laboratorium som utfodring experiment och biokemiska förfarandena för utvinning och metylering av dominerande lipider fraktioner (neutrala lipider, fosfolipider) från Collembola. Det visar hur isotopologue sammansättning av fettsyror analyseras av masspektrometri och beskriver de relaterade formel och beräkningar. Denna procedur resulterar i: a nyckeltal av kulturen som överstiger massa överordnade jonen (dvs fettsyra molekylära jonen M+) av en eller flera massa enheter (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) och (ii) övergripande 13 C anrikning i fettsyror härrör från 13C märkta föregångaren. Även används för Collembola, kan detta tillvägagångssätt generellt tillämpas på någon annan predator-bytesdjur interaktion på premissen att dessa är odlingsbara i tillräcklig mängd under kontrollerade förhållanden att säkerställa en framgångsrik etikett upptag och efterföljande verifiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopologue profilering
En detaljerad analys av de kvantitativa aspekterna i 13C fördelning i FAs behöver spetsteknologi tilldela kol partitionering i näringsvävar. Den nuvarande arbetet anställd isotopologue profilering för att bedöma den 13C /12C nyckeltal i gemensamma FA biomarkörer för tropic interaktioner. Metoden är väl etablerad för aminosyra analys genom vätskekromatografi (LC-MS) och tillämpades för undersökningar av k…
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd från R. Menzel och L. Ruess av den Deutsche Forschungsgemeinschafts (RU RU780/11-1) är erkänt tacksamt. R. Nehring finansierades av RU 780/10-1. Slutligen är vi mycket tacksamma till Dr Hazel Ruvimbo Maboreke för korrekturläsning vår manuskript.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referências
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
