Perfiles de ácidos grasos 13C Isotopologue proporciona una idea de la transferencia trófica de carbono y metabolismo de los lípidos de los consumidores invertebrados
Summary
El enfoque del marcador trófica ácidos grasos, es decir, la asimilación de ácidos grasos como toda molécula y transferencia en tejido consumidor leves o no modificación, se ve obstaculizada por las brechas de conocimiento en el metabolismo de ácidos grasos de invertebrados de suelo pequeño. Isotopologue perfilado se presenta como una valiosa herramienta para desentrañar las interacciones tróficas.
Abstract
Los ácidos grasos (FAs) son biomarcadores útiles en ecología trófica porque normalmente son asimiladas como una molécula completa y transferidos en tejido de consumo con menor o ninguna modificación, lo que permite la dieta encaminamiento entre los diferentes niveles tróficos. Sin embargo, el enfoque de marcador trófica FA todavía está obstaculizado por el conocimiento limitado en el metabolismo lipídico de la fauna del suelo. Este estudio utilizó totalmente con ácido palmítico (C16: 013, 99% del átomo) como trazador en vías de metabolismo de ácidos grasos de dos suelos generalizada Collembola, Protaphorura fimata y Heteromurus nitidus. Para investigar la suerte y la modificación metabólica de este precursor, se presenta un método de generación de perfiles isotopologue, realizado por spectrometry total de ion solo bajo control. Por otra parte, se describe el laboratorio aguas arriba experimento de alimentación, así como la extracción y metilación de fracciones dominantes lípidos (lípidos neutros, fosfolípidos) y los relacionados con fórmula y el cálculo. Isotopologue perfilado no sólo rendimiento el enriquecimiento de 13C total de ácidos grasos derivado de 13C etiquetado precursor pero también produce el patrón de isótopos superior a la masa del ion del padre (es decir, el ion molecular de la FA M+) de cada etiqueta FA por una o más unidades de masa (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Este conocimiento permite conclusiones sobre la relación de la encaminamiento de la dieta de un FA enteramente consumida en comparación con la biosíntesis de novo . El isotopologue perfilado se sugiere como una herramienta útil para la evaluación del metabolismo de ácidos grasos en animales del suelo desenredar las interacciones tróficas.
Introduction
En un hábitat críptico como suelo, relaciones tróficas son difíciles de dirección y otros están restringidas por el tamaño pequeño de la fauna. La última década ha visto avances en ecología bioquímica, particularmente en el uso de ácidos grasos como biomarcadores para definir las estrategias de alimentación de la fauna del suelo bajo condiciones de campo1,2,3. Esto es basado en el hecho de que ácidos grasos de recursos puede ser incorporados en el tejido del consumidor como moléculas de todas, un proceso denominado enrutamiento dieta4. Transferencia de los ácidos grasos se ha divulgado en tres niveles tróficos, es decir, de hongos a los nematodos para Collembola5. Recientemente, la fauna depredadora se consideró6,7 y las primeras revisiones sobre los ácidos grasos como marcadores tróficos en cadenas alimentarias de suelo han sido publicados8,9.
Información más detallada sobre las interacciones tróficas se alcanza por el isótope estable ácidos grasos (FA-SIP) de sondeo. La determinación de 13C12C proporción en ácidos grasos de las dietas y los consumidores pueden atribuir vínculos binarios y estimar el flujo de carbono asociado, y se ha empleado en terrestre, agua dulce y marinos tróficas10,11 ,12,13. El supuesto básico es que ácidos grasos enrutados dietéticos no están sujetos a procesos enzimáticos; por lo tanto, sus 13C de la señal, es decir, 13C /12C cociente del ácido graso, el consumo es similar a la de la dieta1. Sin embargo, un agotamiento gradual de la firma de 13C en la cadena alimentaria se ha divulgado en los sistemas acuáticos, así obstaculizando el amplio uso de FA-SIP en Estudios tróficos14,15,16. Por otra parte, el conocimiento en el metabolismo de los lípidos en la mayoría de invertebrados en redes tróficas terrestres es todavía limitado.
La comprensión de las vías del metabolismo de lípido en los consumidores es esencial para el uso de ácidos grasos de marcador tróficas como medios para la determinación de los flujos de carbono cuantitativa en ecología trófica. Con esto en mente, 13C-isotopologue perfiles, que en principio puede ser aplicado para la investigación del metabolismo del carbono de cualquier sistema biológico17, es un método prometedor. Después de la introducción de un sustrato de carbono marcada con C 13, la distribución de los 13C en la red metabólica es rastreable desde los productos metabólicos generados en la Feria del consumidor una distribución específica isotopologue. Esto podrá evaluarse cuantitativa resonancia metabólica nuclear espectroscopia18,19 o espectrometría de masas20,21, con las muestras biológicas favorecidas en este último con baja biomasa debido a su mayor sensibilidad.
Aunque isotopologue perfiles ha sido exitosamente aplicado a aminoácidos y proporciona información sobre el metabolismo de carbono en vivo de patógenos bacterianos17,22,23, su implementación en grasos ácidos se ha rezagado. Recientemente se realizó el primer análisis detallado sobre el destino de un isótopo estable que etiqueta del ácido graso precursor, su dieta enrutamiento o degradación a través β-oxidación, en consumidores invertebrados de suelo, por Menzel et al. 24. aquí, se proporcionan las bases metodológicas para los experimentos de incorporación con 13C con ácidos grasos seguidos isotopologue análisis de los principales descendientes de invertebrados de suelo frecuentes, Collembola,. Estos microartrópodos son un grupo de buen modelo ya que son componentes importantes de la web de alimentos del suelo y son bien investigados para su marcador trófica ácidos grasos8,25.
La comprensión de las vías del metabolismo de lípido en los consumidores es esencial para el uso de ácidos grasos de marcador tróficas como medios para la determinación de los flujos de carbono cuantitativa en ecología trófica. El presente Protocolo da el diseño y montaje de un laboratorio de experimento y los procedimientos bioquímicos para la extracción y metilación de las fracciones dominantes de lípidos (lípidos neutros, fosfolípidos) de alimentación de Collembola. Demuestra cómo el isotopologue composición de ácidos grasos se analiza por espectrometría de masas y describe la fórmula relacionado y los cálculos. Este procedimiento resulta en: (i) las relaciones de superior a la masa del ion del padre (es decir, el ión molecular del ácido graso M+) por uno o más isótopos de masa unidades (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) y (ii) el total 13 C enriquecimiento en ácidos grasos derivados de los precursores con 13C. Aunque utiliza para Collembola, este enfoque puede aplicarse generalmente a cualquier otro tipo de interacción depredador-presa en la premisa de que son cultivables en cantidad suficiente en condiciones controladas para asegurar una captación exitosa etiqueta y posterior verificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopologue perfiles
Un análisis detallado de los aspectos cuantitativos en la distribución de 13C en FAs necesita tecnología de punta para asignar carbono repartir en redes tróficas. El presente trabajo empleado isotopologue perfilado para evaluar 13C /12C relaciones en común biomarcadores de FA para las interacciones trópico. Este método es establecido para el análisis de aminoácidos por cromatografía líquida (LC-MS) y se aplicó …
Acknowledgements
Se agradece el apoyo financiero de la R. Menzel y L. Ruess por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring fue financiado por RU 780/10-1. Finalmente, estamos muy agradecidos al Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para corregir el manuscrito.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referências
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
