Ácido graxo 13C Isotopólogo de criação de perfil fornece insights sobre transferência de carbono trófica e metabolismo lipídico dos consumidores invertebrados
Summary
A abordagem de marcador trófica de ácido graxo, ou seja, a assimilação dos ácidos graxos como molécula inteira e transferência em tecido de consumidor com n ou menor modificação, é dificultado por lacunas de conhecimento no metabolismo de ácidos graxos de invertebrados de solo pequeno. Isotopólogo de criação de perfil é fornecida como uma valiosa ferramenta de desvencilhar interações tróficas.
Abstract
Ácidos graxos (FAs) são úteis biomarcadores em ecologia alimentar da web porque eles são normalmente assimilados como uma molécula completa e transferidos para o tecido do consumidor com menor ou nenhuma modificação, permitindo o roteamento dietética entre diferentes níveis tróficos. No entanto, a abordagem de marcador trófica FA ainda é dificultada pelo conhecimento limitado no metabolismo lipídico da fauna do solo. Este estudo utilizou inteiramente rotulado ácido palmítico (13C16:0, 99% de átomo) como marcador no ácido graxo vias de metabolismo de dois generalizada do solo Collembola, Protaphorura fimata e Heteromurus nitidus. Para investigar o destino e modificações metabólicas deste precursor, é apresentado um método de criação de perfil Isotopólogo, realizada por espectrometria de massa usando o único íon monitoramento. Além disso, o montante laboratório experiência de alimentação é descrito, bem como a extração e a metilação de fracções lipídicas dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) e a fórmula relacionada e cálculos. Isotopólogo de perfil não só rendimento o enriquecimento global de 13C em ácidos graxos derivado a 13C rotulado precursor mas também produz o padrão de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular de FA M+) de cada rotulado FA por uma ou mais unidades de massa (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.). Este conhecimento permite conclusões sobre o rácio de roteamento dietético de um FA inteiramente consumido em comparação com a biossíntese de novo . Isotopólogo perfil é sugerido como uma ferramenta útil para a avaliação do metabolismo de ácidos graxos em animais de solo de desvencilhar interações tróficas.
Introduction
Em um habitat enigmático como o solo, relações tróficas são difíceis de abordar e são ainda mais restritos pelo pequeno tamanho da fauna. A última década viu avanços na ecologia bioquímica, particularmente no uso de ácidos graxos como biomarcadores para definição de estratégias de alimentação da fauna de solo sob condições de campo a1,2,3. Isto é baseado no fato de que ácidos graxos de recursos podem ser incorporados no tecido do consumidor como moléculas inteiras, um processo denominado de roteamento dietético4. Transferência de ácidos graxos relatou sobre três níveis tróficos, ou seja, dos fungos para nematoides de Collembola5. Recentemente, a fauna predatória considerou-se6,7 e os primeiro comentários sobre os ácidos graxos como marcadores tróficas em solo tróficas foram publicadas8,9.
Informações mais detalhadas sobre interações tróficas são alcançadas por ácido graxo isótopo estável sondagem (FA-SIP). A determinação de 13C /12C rácios em ácidos graxos em dietas e os consumidores podem atribuem links binário e estimam o fluxo de carbono associado e tem sido empregados em terrestre, água doce e marinhos tróficas10,11 ,12,13. O pressuposto básico é que a dietéticos roteado os ácidos graxos não são sujeitas a processos enzimáticos; Portanto, seus 13C sinal, ou seja, a 13C /12C relação do ácido gordo, em que o consumidor é semelhante ao que na dieta1. No entanto, um empobrecimento gradual da assinatura 13C a cadeia alimentar tem sido relatado em sistemas aquáticos, dificultando, assim, ampla aplicação da FA-SIP em estudos trófica14,15,16. Além disso, o conhecimento no metabolismo lipídico na maioria dos invertebrados terrestres teias alimentares é ainda limitado.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. Com isto em mente, 13C-Isotopólogo de criação de perfil, que em princípio pode ser aplicado para investigação do metabolismo carbono de qualquer sistema biológico17, é um método promissor. Após a introdução de um substrato de carbono marcado com 13, a distribuição dos 13C na rede metabólica é rastreável desde os produtos metabólicos gerados no show do consumidor uma distribuição específica de Isotopólogo. Isto pode ser avaliado por espectroscopia de ressonância metabólica nuclear quantitativa18,19 ou20,espectrometria de massa21, com as último favorecido em amostras biológicas com baixa biomassa devido à sua maior sensibilidade.
Embora Isotopólogo de criação de perfil foi com êxito aplicada aos aminoácidos e forneceu insights sobre o metabolismo de carbono na vivo de patógenos bacterianos17,22,23, sua implementação em gordos ácidos já ficou para trás. A primeira análise detalhada sobre o destino de um isótopo estável rotulados precursor de ácidos gordos, sua dieta roteamento ou degradação através da β-oxidação, em consumidores de invertebrados de solo, foi recentemente realizada por Menzel et al 24. aqui, os princípios metodológicos para experiências de incorporação com 13C rotulados de ácidos graxos, seguidos de análise Isotopólogo de chaves descendentes em invertebrados de solo frequentes, o Collembola, são fornecidos. Estas variedade é um grupo de modelo bom como eles formam componentes importantes do solo comida web são bem investigado por seus marcador trófica ácidos graxos8,25.
A compreensão as vias de metabolismo de lipídios nos consumidores é essencial para o uso de ácidos graxos de marcador trófica como meios para a determinação do fluxo de carbono quantitativa em ecologia alimentar da web. O presente protocolo dá o projeto e configurar para um laboratório de experimento e os processos bioquímicos de extração e metilação de frações de lipídios dominante (lipídios neutros, fosfolipídios) de alimentação de Collembola. Ele demonstra como a Isotopólogo a composição de ácidos graxos é analisada por espectrometria de massa e descreve a fórmula relacionada e cálculos. Este procedimento resulta em: (i) os rácios de isotopologues deve exceder a massa do íon pai (ou seja, o íon molecular do ácido graxo M+) por uma ou mais massa unidades (M+ 1M+ 2, M+ 3, etc.) e (ii) total 13 C enriquecimento em ácidos graxos derivado o precursor rotulados de 13C. Embora usado para Collembola, esta abordagem geralmente pode ser aplicada a qualquer outra interação predador-presa na premissa de que estes são viáveis em quantidade suficiente sob condições controladas para garantir uma absorção bem sucedido rótulo e subsequente verificação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopólogo de perfil
Uma análise detalhada dos aspectos quantitativos em distribuição de 13C no FAs precisa de tecnologia de ponta para atribuir carbono particionamento em teias alimentares. O presente trabalho empregado Isotopólogo de criação de perfil para avaliar a 13C /12C rácios em comuns biomarcadores de FA para interações tropicais. Esse método é bem estabelecido para a análise de aminoácidos por cromatografia líquida (LC…
Acknowledgements
O apoio financeiro da R. Menzel e L. Ruess pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) é reconhecido com gratidão. R. Nehring foi financiado por RU 780/10-1. Finalmente, somos extremamente gratos ao Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke para revisão de nosso manuscrito.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referências
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