Fettsyrer 13C Isotopologue profilering gir innsikt i Trophic karbon overføring og Lipid metabolismen av virvelløse forbrukere
Summary
Fettsyrer trophic markør tilnærming, dvs. assimilering av fettsyrer som hele molekylet og overføring til forbruker vev med ingen eller liten endring, er hemmet av kunnskapshull i fettsyrer metabolismen av små jord virvelløse dyr. Isotopologue profilering er gitt som et verdifullt verktøy for å greie trophic interaksjoner.
Abstract
Fettsyrer (FAs) er nyttig biomarkers i næringskjeden økologi fordi de er vanligvis assimilert som et komplett molekyl og overført til forbruker vev med liten eller ingen endring, slik at kosttilskudd ruting mellom ulike nivåer i næringskjeden. FA trophic markør tilnærming er imidlertid fortsatt hindret av begrenset kunnskap i lipid metabolismen av jord faunaen. Denne studien brukt helt merket palmitinsyre (13C16:0, 99 atom %) som en tracer i fettsyrer metabolisme stier av to utbredt jord Collembola, Protaphorura fimata og Heteromurus nitidus. For å undersøke skjebnen og metabolske modifikasjoner av dette forløper, presenteres en metode for isotopologue profilering, utført av massespektrometri bruker enkelt ion overvåking. Videre er oppstrøms laboratoriet fôring eksperimentet beskrevet, og utvinning og metylering dominerende lipid fraksjoner (nøytral lipider, fosfolipider) og relaterte formelen og beregninger. Isotopologue profilering ikke bare gir samlede 13C anriking på fettsyrer avledet fra 13C merket forløper men produserer også mønster av isotopologues overstiger masse overordnede ion (dvs. FA molekylær ion M+) av hver merket FA med én eller flere masse enheter (M+ 1M2M3, etc.). Denne kunnskapen kan konklusjoner på forholdet mellom kosttilskudd ruting av en helt fortært FA i forhold til de novo biosyntesen. Isotopologue profilering er foreslått som et nyttig verktøy for evaluering av fettsyrer metabolismen i jord dyr å greie trophic interaksjoner.
Introduction
Kryptiske livsmiljøet som jord, trophic relasjoner er vanskelig å adresse og er begrenset av den lille størrelsen på dyrelivet. Det siste tiåret har sett fremskritt i biokjemiske økologi, spesielt i bruk av fettsyrer som biomarkers for å definere fôring strategier for jord faunaen under feltet forhold1,2,3. Dette er basert på det faktum at fettsyrer fra ressurser kan innlemmes i forbruker vev som hele molekyler, en prosess kalt kosttilskudd rute4. Overføring av fettsyrer har blitt rapportert over tre nivåer i næringskjeden dvs fra sopp å nematoder Collembola5. Nylig ROV faunaen ble ansett6,7 og første anmeldelser på fettsyrer som trophic markører i jord næringskjeder har vært publisert8,9.
Mer detaljert informasjon om trophic interaksjoner er oppnådd ved fettsyrer stabil isotop undersøkelser (FA-SIP). Fastsettelse av 13C /12C prosenter i fettsyrer i kosten og forbrukere kan tilskrive binære koblinger og beregne tilhørende carbon flyten, og har vært ansatt i bakkenettet, ferskvann og marine næringskjeder10,11 ,12,13. Den grunnleggende forutsetningen er at kosttilskudd distribuert fettsyrer ikke er underlagt enzymatisk prosesser; derfor deres 13C signal, dvs. den 13C /12C fettsyrer, i forbrukeren er lik som i kosthold1. Imidlertid er en gradvis uttømming av 13C signaturen opp i næringskjeden rapportert i akvatiske systemer, og dermed hindre bred anvendelse av FA-SIP i trophic studier14,15,16. Videre er kunnskap i lipid stoffskiftet i de fleste dyr i terrestriske næringskjeder fortsatt begrenset.
En forståelse av lipid metabolisme veier i forbrukere er viktig for bruken av trophic markør fettsyrer som betyr for fastsettelse av kvantitative karbon flyten i næringskjeden økologi. Med dette i bakhodet, 13C-isotopologue profilering, som i prinsippet kan brukes for undersøkelse av karbon metabolismen av noen biologiske system17, er en lovende metode. Etter innføringen av et 13C-merket karbon substrat fordelingen av 13C i metabolske nettverket er sporbare siden generert metabolske produktene i forbruker viser en bestemt isotopologue distribusjon. Dette kan bli vurdert av kvantitative kjernefysiske metabolske resonans spektroskopi18,19 eller massespektrometri20,21, med de siste favorisert i biologiske prøvene med lav biomasse på grunn av sin høyere følsomhet.
Selv om isotopologue profilering har blitt med hell brukt aminosyrer og innsikt i karbon i vivo metabolismen av bakteriell patogener17,22,23, gjennomføringen fatty syrer ligget. Den første detaljerte analysen på skjebnen til en stabil isotop merket forløper fettsyrer, sin kosttilskudd ruting eller degradering via β-oksidasjon, i jord virvelløse forbrukere, ble nylig utført av Menzel et al. 24. her, det metodologiske grunnleggende for inkorporering eksperimenter med 13C merket fettsyrer etterfulgt av isotopologue analyse av viktige etterkommere i hyppige jord dyr, Collembola, tilbys. Disse microarthropods er en god modell som de danner viktige komponenter av jord næringskjeden og er godt undersøkt for sin trophic markør fettsyrer8,25.
En forståelse av lipid metabolisme veier i forbrukere er viktig for bruken av trophic markør fettsyrer som betyr for fastsettelse av kvantitative karbon flyten i næringskjeden økologi. Nåværende protokollen gir utformingen og oppsettet til et laboratorium fôring eksperimentet og biokjemiske prosedyrer for utvinning og metylering av dominerende lipider fraksjoner (nøytral lipider, fosfolipider) fra Collembola. Den viser hvordan isotopologue sammensetningen av fettsyrer analyseres av massespektrometri beskriver relaterte formelen og beregninger. Denne prosedyren gir: (i) prosenter av isotopologues overstiger masse overordnede ion (dvs. fettsyrer molekylær ion M+) med en masse enheter (M+ 1M2M3, etc.) og (ii) totalt 13 C berikelse på fettsyrer avledet fra 13C merket forløperen. Selv om brukes til Collembola, kan denne tilnærmingen generelt brukes på noen andre rovdyr-byttedyr interaksjon på premisset om at disse er culturable i tilstrekkelig mengde under kontrollerte forhold å sikre en vellykket merket uptake og påfølgende verifikasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopologue profilering
En detaljert analyse av de kvantitative aspektene i 13C distribusjon i FAs må banebrytende teknologi tilordne karbon partisjonering i næringskjeder. Dette arbeidet ansatt isotopologue profilering for å vurdere den 13C /12C prosenter i vanlige FA biomarkers for tropic interaksjoner. Denne metoden er godt etablert for aminosyre analyse av flytende kromatografi (LC-MS) og ble brukt for undersøkelser av karbon stoffskif…
Acknowledgements
Økonomisk støtte til R. Menzel og L. Ruess av Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) er takknemlig anerkjent. R. Nehring ble finansiert av RU 780/10-1. Til slutt, vi er svært takknemlig til Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke for korrekturlesing av våre manuskriptet.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referências
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
