Acido grasso 13C Isotopologue profilatura fornisce approfondimenti trasferimento trofico carbonio e metabolismo dei lipidi dei consumatori invertebrati marini
Summary
L’approccio di marcatore trofica dell’acido grasso, vale a dire, l’assimilazione degli acidi grassi come intera molecola e trasferimento nel tessuto dei consumatori con no o minori modifiche, è ostacolata da lacune nel metabolismo dell’acido grasso di invertebrati del suolo piccolo. Isotopologue profilatura viene fornito come un prezioso strumento per districarsi tra interazioni trofiche.
Abstract
Gli acidi grassi (FAs) sono biomarcatori utili in ecologia alimentare web perché in genere sono assimilati come una molecola completa e trasferiti nel tessuto dei consumatori con minore o nessuna modifica, che consente il routing dietetico tra diversi livelli trofici. Tuttavia, l’approccio di trofico marcatore FA è ancora ostacolata dalla conoscenza limitata nel metabolismo dei lipidi della fauna del suolo. Questo studio ha utilizzato interamente etichettato acido palmitico (C16: 013, 99% di atomo) come tracciante nelle vie di metabolismo dell’acido grasso del suolo diffuso due Collembola, Protaphorura fimata e Heteromurus nitidus. Al fine di indagare il destino e metaboliche modifiche di questo precursore, è presentato un metodo di profiling isotopologue, eseguita mediante spettrometria di massa utilizzando Monitoraggio singolo ione. Inoltre, il laboratorio a Monte alimentazione esperimento è descritto, così come l’estrazione e la metilazione delle frazioni lipidiche dominante (lipidi neutri, fosfolipidi) e formula correlata e dei calcoli. Profilatura di Isotopologue non solo rendimento complessivo 13C arricchimento in acidi grassi derivato da 13C etichettato precursore, ma produce anche il modello di isotopomeri supera la massa dello ione genitore (vale a dire, lo ione molecolare FA M+) di ciascuna etichetta FA da uno o più unità di massa (M+ 1, M+ 2, M+ 3, ecc.). Questa conoscenza permette di conclusioni sul rapporto di routing dietetica di un FA interamente consumato rispetto biosintesi de novo . La profilatura di isotopologue è suggerita come uno strumento utile per la valutazione del metabolismo dell’acido grasso in animali di suolo per districare le interazioni trofiche.
Introduction
In un habitat criptico come il suolo, le relazioni trofiche sono difficili da indirizzo e sono ulteriormente limitate dalle ridotte dimensioni della fauna. Nell’ultimo decennio ha visto progressi in ecologia biochimica, specialmente nell’uso degli acidi grassi come biomarcatori per la definizione di strategie d’alimentazione della fauna del suolo sotto campo condizioni1,2,3. Questa è basata sul fatto che gli acidi grassi dalle risorse possono essere incorporati nel tessuto dei consumatori come molecole intero, un processo definito dietetico routing4. Trasferimento degli acidi grassi è stato segnalato oltre tre livelli trofici, cioè, dai funghi ai nematodi a Collembola5. Recentemente, la fauna predatoria era considerata6,7 e le prime recensioni su acidi grassi come marcatori trofici in reti alimentari del suolo sono stati pubblicati8,9.
Informazioni più dettagliate sulle interazioni trofiche sono raggiunto da acido grasso isotopo stabile probing (FA-SIP). La determinazione di 13C /12C rapporti in acidi grassi nelle diete e i consumatori possono attribuiscono binari collegamenti e stimano il flusso di carbonio associati ed sono stati impiegati in terrestre, acqua dolce e marini food webs10,11 ,12,13. Il presupposto di base è che gli acidi grassi dietetici indirizzati non sono soggetti a processi enzimatici; di conseguenza, il loro 13C segnale, vale a dire, 13C /12C rapporto dell’acido grasso, il consumatore è simile a quella di dieta1. Tuttavia, un progressivo esaurimento della firma 13C lungo la catena alimentare è stato segnalato in sistemi acquatici, ostacolando così vasta applicazione di FA-SIP in studi trofiche14,15,16. Inoltre, la conoscenza nel metabolismo dei lipidi nella maggior parte degli invertebrati in reti alimentari terrestri è ancora limitata.
Comprendere le vie del metabolismo dei lipidi nei consumatori è essenziale per l’utilizzo degli acidi grassi trofiche marcatore come mezzi per la determinazione del flusso di carbonio quantitativa in ecologia alimentare web. Con questo in mente, 13C-isotopologue di profilatura, in linea di principio può essere applicato per le indagini del metabolismo del carbonio di qualsiasi sistema biologico17, è un metodo di promessa. A seguito dell’introduzione di un substrato di carbonio C-etichettati 13, la distribuzione di 13C nella rete metabolica è rintracciabile poiché i prodotti metabolici generati nello spettacolo dei consumatori una distribuzione specifica isotopologue. Questo può essere valutato da quantitativi di risonanza nucleare metabolica spettroscopia18,19 o spettrometria di massa20,21, con i campioni biologici favoriti in quest’ultimi con biomassa bassa a causa della sua maggiore sensibilità.
Anche se isotopologue profilatura è stato correttamente applicato agli aminoacidi e fornito la comprensione nel metabolismo del carbonio in vivo di batteri patogeni17,22,23, sua attuazione in grassi acidi è rimasta indietro. La prima analisi dettagliata sul destino di un isotopo stabile etichettati precursore degli acidi grassi, sua dietetico routing o degradazione attraverso β-ossidazione, nei consumatori di invertebrati del suolo, è stata recentemente eseguita da Menzel et al. 24. qui, le basi metodologiche per esperimenti di incorporazione con 13C etichettati acidi grassi seguiti dall’analisi di isotopologue di chiavi discendenti in invertebrati del suolo frequenti, i collemboli, sono fornite. Questi microartropodi sono un gruppo di buon modello formano importanti componenti della rete alimentare del suolo e sono ben studiati per loro marcatore trofiche acidi grassi8,25.
Comprendere le vie del metabolismo dei lipidi nei consumatori è essenziale per l’utilizzo degli acidi grassi trofiche marcatore come mezzi per la determinazione del flusso di carbonio quantitativa in ecologia alimentare web. Il presente protocollo dà la progettazione e la messa a punto per un laboratorio alimentare esperimento e le procedure biochimiche per estrazione e metilazione delle frazioni di lipidi dominante (lipidi neutri, fosfolipidi) da collemboli. Dimostra come la composizione di isotopologue degli acidi grassi è analizzata tramite spettrometria di massa e descrive la relativa formula e calcoli. Questa procedura comporta: (i) i rapporti di isotopomeri supera la massa dello ione genitore (vale a dire, lo ione molecolare dell’acido grasso M+) da uno o più di massa unità (M+ 1, M+ 2, M+ 3, ecc.) e (ii) la complessiva 13 C arricchimento in acidi grassi derivati dal precursore etichettati 13C. Anche se usato per Collembola, questo approccio in genere può essere applicato a qualsiasi altra interazione predatore-preda sulla premessa che questi sono coltivabili in quantità sufficiente in condizioni controllate per garantire un assorbimento efficace delle etichette e le successive Verifica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Profilo di Isotopologue
Un’analisi dettagliata degli aspetti quantitativi nella distribuzione di 13C in FAs ha bisogno di una tecnologia all’avanguardia per assegnare carbonio partizionamento in reti alimentari. Il presente lavoro impiegato isotopologue profilatura per valutare il 13C /12C rapporti in comune biomarcatori FA per interazioni tropici. Questo metodo è affermato per l’analisi dell’amminoacido mediante cromatografia liquida (LC-MS) …
Acknowledgements
Si ringraziano il sostegno finanziario di Menzel R. e L. Ruess dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1). R. Nehring è stato finanziato da RU 780/10-1. Infine, siamo estremamente grati a Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke per la correzione del nostro manoscritto.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referências
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