Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов
Summary
Для фракционирования растворимых и нерастворимых мутант гентингтина видов от мыши мозга и клетки культуры описан метод. Метод, описанный полезен для характеристик и количественной оценки потока белок гентингтин и СПИДа в анализе белка гомеостаза в патогенезе заболевания и при наличии возмущений
Abstract
Накопление смятых протеинов имеет центральное значение для патологии в болезни Гентингтона (HD) и многих других нейродегенеративных расстройств. В частности ключевой особенностью патологических HD это ненормальное накопление Мутантный белок HTT (mHTT) в высокой молекулярной массой комплексов и внутриклеточные включения органы, состоящие из фрагментов и других белков. Традиционные методы измерения и понять, что вклад различных форм mHTT содержащих агрегаты включают микроскопии флуоресцирования, Западный анализ помаркой и фильтра улавливания анализов.
Однако большинство из этих методов являются конформации конкретным и поэтому не может разрешить полное состояние потока белка mHTT из-за сложного характера агрегатные растворимость и резолюции.
Для определения совокупных mHTT и различных модифицированных форм и комплексов разделения и солюбилизация клеточных агрегатов и фрагменты является обязательным. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и визуализировать растворимых mHTT, мономеры, олигомеры, фрагменты, и нерастворимые высокомолекулярные (HMW) накопленных mHTT видов. HMW mHTT треки с прогрессирования заболевания, соответствует мыши поведения отсчетов и было выгодно модулированные некоторых терапевтических вмешательств1. Этот подход может использоваться с мыши мозга, периферических тканях и культуру клеток, но могут быть адаптированы к другие модели систем или болезни контекстах.
Introduction
Разрушение белка контроля качества сетей, которые обеспечивают надлежащего складные и деградации клеточных белков — вероятно, центральное место в патологии в болезни Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD) и другие «сворачиванию белков» расстройства,2,3. Глубокое понимание proteostasis сетевые компоненты и их вклад в патологии Поэтому решающее значение для разработки более терапевтических вмешательств. HD это вызвано ненормальное расширение CAG повторять в течение HD гена, что приводит к расширенный участок polyglutamines (polyQ) в белок гентингтин (НТТ)4. Последовательное патологических особенностью патогенеза HD является полученный сворачиванию, накопление и агрегирования HTT в регионах мозга и периферических тканях, который был показан несколькими способами мешать нормальной клетки гомеостаза и функции 5 , 6. Хотя HTT повсеместно выражается, средний колючий нейронов в стриатума выборочно уязвимых и наиболее открыто пострадавших с заметных корковой атрофии, также связанные с HD патогенеза.
Формирование агрегатов HTT в мозге животных моделей и HD пациентов обычно служил прокси маркера для прогрессирования заболевания и Доминант отрицательный прирост функции для mHTT7. Хотя конкретные механизмы, которые белка сворачиванию и агрегирование может способствовать mHTT индуцированной токсичности остаются неясными, инвариантная и неизбежной особенностью является формирование этих включений в мозге пациентов HD и различных животных моделей. Включений появляются состоять главным образом из накопленных HTT фрагменты, содержащие N-терминальный расширил polyQ, указывающее, что Протеолиз и обработку полноразмерных HTT, а также альтернативного сплайсинга8,9 может играть важную роль в патогенезе HD. N-терминальный HTT фрагментов могут представлять собой патологические формы HTT, который может быстро объединять, nucleate и ускорить или распространять процесс агрегации10.
Однако присутствие этих включений не обязательно коррелирует с НТТ индуцированной токсичности или клеток смерть11. HTT было предложено пройти процесс агрегации из растворимых мономера через растворимых олигомерных видов и β-лист фибриллами нерастворимых агрегатов и включений12. Урегулирование этих различных видов белков через стандартный биохимических анализов был вызов в области из-за их стабильность, низкая-моющее средство литического буфера и сложности в визуализации с помощью стандартных биохимических анализов. Таким образом методологические соображения имеют решающее значение в выявлении степени и шаблон накопленные и агрегированных mHTT.
Протокол, представленные здесь предоставляет метод для визуализации несколько промежуточных HTT, специально образование нерастворимых HMW HTT видов, который появляется внимательно отслеживать с HD патогенеза и болезнь прогрессии1,13 ,14. Будучи в состоянии решить и отслеживать несколько видов mHTT обеспечивает исследователей биохимических инструмент для изучения патогенеза заболевания и оценки потенциальных терапевтических вмешательств через их модуляции и влияние на патогенез болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые меры предосторожности необходимы для вышеуказанных протоколов для обеспечения последовательного и количественных результатов. Во-первых, mHTT в обеих фракций спонтанно образуют агрегаты со временем на несколько циклов замораживания-оттаивания, особенно когда в высокой конц…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH (RO1-NS090390). Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джоан Steffanfor технической помощи и обсуждения в ходе разработки этот assay.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
Referências
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
