फ़िरोज़ा killifish के प्रयोगशाला आवास घर के लिए बढ़ाया जा सकता है और कुशलता से एक केंद्रीकृत पानी छानने का काम प्रणाली में व्यक्तिगत मछली के हजारों बढ़ा, एक ही मानक zebrafish सुविधाओं के लिए इस्तेमाल किया बुनियादी सुविधाओं को रोजगार । यहां हम विस्तार मानकीकृत प्रक्रियाओं की एक सूची है कि कुशल killifish रखरखाव की अनुमति ।
प्रायोगिक प्रयोजनों के लिए प्रयुक्त गैर-मॉडल प्रयोगशाला मछली में पशुपालन पद्धतियों के विकास से zebrafish और medaka जैसे संदर्भ मछली मॉडल प्रणालियों की स्थापना से काफी लाभ हुआ है. हाल के वर्षों में, एक उभरती हुई मछली-फ़िरोज़ा killifish (Nothobranchius furzeri) – उम्र बढ़ने और पारिस्थितिकी के जीवविज्ञान के क्षेत्रों में अनुसंधान समूहों की बढ़ती संख्या के द्वारा अपनाया गया है. 4-8 महीने के एक बंदी जीवन अवधि के साथ, इस प्रजाति के सबसे कम रहते हड्डीवाला कैद में उठाया और वैज्ञानिक समुदाय परीक्षण के लिए अनुमति देता है-एक कम समय में-प्रयोगात्मक हस्तक्षेप है कि उंर बढ़ने की दर और जीवन प्रत्याशा के परिवर्तन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रजाति के अद्वितीय जीवविज्ञान को देखते हुए, भ्रूण diapause, विस्फोटक यौन परिपक्वता, चिह्नित रूपात्मक और व्यवहार यौन dimorphism की विशेषता-और उनके अपेक्षाकृत कम वयस्क जीवन काल- तदर्थ पशुपालन प्रथाओं अत्यावश्यक में हैं मांग. इस प्रोटोकॉल कुंजी पशुपालन उपाय है कि इष्टतम फ़िरोज़ा killifish प्रयोगशाला देखभाल, वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगशाला पशु मॉडल के रूप में इस प्रजाति को अपनाने को सक्षम करने की अनुमति का एक सेट की रिपोर्ट ।
अपने छोटे जीवन काल और तेजी से जीवन चक्र को देखते हुए, फ़िरोज़ा killifish तेजी से जीव विज्ञान1,2,3में एक होनहार नए मॉडल जीव के रूप में बढ़ रहे हैं । इस प्रजाति के एक teleost के लिए एक अनूठा जीवन चक्र की विशेषता है, भ्रूण diapause से मिलकर, तेजी से यौन परिपक्वता, और एक विस्तारित पोस्ट-प्रजनन जीवन स्टेज4,5. हाल ही में काम दोनों कैद में और जंगली6,7में इस प्रजाति के जीव विज्ञान elucidating में योगदान दिया है । फ़िरोज़ा killifish मौसमी ताजा पानी निकायों में रहते हैं जो जिंबाब्वे और मोजाम्बिक में अफ्रीकी सवाना में बरसात के मौसम के दौरान बनाते हैं । शुष्क मौसम के दौरान, भ्रूण एक तनाव प्रतिरोधी जीवन diapause बुलाया मंच के आधार पर पानी के अभाव में सूखी कीचड़ में जीवित रहते हैं ।
इस प्रजाति के लिए आनुवंशिक नक्शे8,9उत्पंन किया गया है, और हाल ही में उनके जीनोम का अनुक्रम किया गया है और10,11इकट्ठे हुए । कई नस्लीय प्रयोगशाला मछली उपभेदों विकसित किया गया है, और transgenesis और CRISPR/Cas9 के माध्यम से जीनोम संपादन इस प्रजाति में उपलब्ध हो गए हैं, वास्तविक एक प्रतियोगी प्रयोगशाला हड्डीवाला मॉडल जीव के रूप में फ़िरोज़ा killifish को बढ़ावा देने 12,13,14.
हालांकि एक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल पहले से ही इस प्रजाति के लिए प्रकाशित किया गया है15, वर्तमान प्रोटोकॉल में हम प्रयोगात्मक प्रयोगशाला दिशानिर्देश है कि विशेष रूप से अध्ययन है कि उंर बढ़ने और अस्तित्व की जांच के उद्देश्य से कर रहे है की एक व्यापक सूची विकसित करना । वर्तमान प्रोटोकॉल zebrafish और medaka पशुपालन के साथ पहले से ही परिचित शोधकर्ताओं ने कुंजी समायोजन की एक न्यूनतम संख्या को अपनाने से फ़िरोज़ा killifish पशुपालन में निपुण बनने के लिए सक्षम बनाता है. एक ही समय में, इस प्रोटोकॉल आवश्यक उपकरणों के साथ मछली पालन में पूर्व अनुभव के बिना शोधकर्ताओं के लिए एक संपंन फ़िरोज़ा killifish कॉलोनी बढ़ाने प्रदान करता है ।
हम भ्रूण संग्रह, मशीन, साथ ही वयस्क मछली आवास, प्रजनन, और खिलाने सहित फ़िरोज़ा killifish के प्रयोगशाला संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । हमारे प्रोटोकॉल विशेष प्रयोगशालाओं कि आचरण वयस्क मछली पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान उंर बढ़ने और जीवन काल पर प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए विशेष रूप से लक्षित है । फ़िरोज़ा killifish एक मानक zebrafish सुविधा पर उठाया जा सकता है; हालांकि, killifish पशुपालन के महत्वपूर्ण पहलुओं मानक zebrafish देखभाल से16अलग । ये समायोजन एक नमकीन से जल्दी संक्रमण शामिल-एक आहार के लिए चिंराट केवल आहार प्रोटीन से भरपूर रक्त कृमि के साथ पूरक है, साथ ही भ्रूण की मशीन में विशिष्ट कदम, एक तरल और शुष्क गर्मी मंच से मिलकर ।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम 8-30 डिग्री सेल्सियस तापमान रेंज के भीतर भ्रूण शिपिंग शामिल हैं । प्रजनन के मामले में, fecundity आवृत्ति और भोजन की गुणवत्ता खिलाने पर निर्भर करता है; इसलिए, हम सिफारिश प्रजनन टैंक प्रति एक दिन में कम से कम दो भक्षण भ्रूण उपज बढ़ाने के लिए (५.६ अनुभाग देखें.) । भ्रूण ब्लीचिंग के दौरान ब्लीचिंग सॉल्यूशन में भ्रूण की गर्मी का विस्तार न करें । इससे अंडे की चोरियों को नुकसान हो सकता है और भ्रूण मृत्युदर में वृद्धि हो सकती है । जब methylene नीले रंग के साथ भ्रूण मशीन, तैयार करने के लिए अब से 2 सप्ताह के लिए हैच भ्रूण के रूप में उनकी व्यवहार्यता नाटकीय रूप से कम हो जाएगा की मशीन लंबा नहीं है । फ़िरोज़ा killifish सेने के लिए, humic एसिड समाधान के कम तापमान सेने और समाधान में भ्रूण की पूरी विसर्जन को बेहतर बनाता है सेने सिंक्रनाइज़ अनुमति देता है । पर्याप्त नहीं वातन के उच्च दरों में गर्मी के परिणाम के दौरान गैस मूत्राशय (“पेट-स्लाइडर” phenotype भरने में सक्षम नहीं है, अनुभाग ५.१ में नोट देखें) ।
प्रजनन के लिए प्रोटोकॉल की सीमा रेत सब्सट्रेट जो केंद्रीकृत निस्पंदन सिस्टम के लिए चुनौतियां बन गया है और भविष्य में वैकल्पिक तरीकों से प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए का उपयोग भी शामिल है । संभव विकल्प zebrafish प्रजनन टैंक का उपयोग हो सकता है । भ्रूण ब्लीचिंग अंडे की चोरियों में प्रमुख शारीरिक-रासायनिक परिवर्तन है कि बदल चोरियों शरीर विज्ञान और सेने सफलता में परिणाम सकता है पैदा कर सकता है । methylene नीले भ्रूण के निरंतर जोखिम वयस्क मछली शरीर क्रिया विज्ञान में दीर्घकालिक परिवर्तन के लिए प्रेरित कर सकते हैं । अस्तित्व पलटने के लिए व्यक्तिगत टैंक में वयस्क मछली स्थापना अध्ययन नकारात्मक मछली व्यवहार और स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं । हालांकि, जीवन रक्षा पलटन अध्ययन के लिए समूह आवास सामाजिक प्रभुत्व और पुरुष शासित प्रदेशों की स्थापना के कारण महत्वपूर्ण निराधार कारक कहते हैं, जो कि सख्त सामाजिक पदानुक्रमों में अग्रणी है । इसलिए, हम ंयायाधीश कि अस्तित्व के अध्ययन के लिए पुरुष मछली का अलगाव एक उचित समझौता है । संयुक्त राष्ट्र द्वारा नियंत्रित स्रोतों से जीना भोजन के साथ प्रयोगशाला killifish कालोनियों खिला परजीवी और संभावित रोगजनक माइक्रोबियल समुदायों से बाहरी संदूषणों के लिए एक जोखिम जोड़ें । भविष्य में, एक तदर्थ बाँझ मछली फ़ीड विकसित किया जाना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य में सुधार एक नियंत्रित, गैर रहने आहार है, जो अभी भी 3-4 सप्ताह के भीतर यौन परिपक्वता को पूरा करने की ओर जाता है पर ध्यान दिया जाएगा । संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल फ़िरोज़ा killifish प्रयोगशाला संवर्धन करने के लिए एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए पहुंच प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, ऐनी Brunet, सबरीना शार्प, Mickie पॉवेल, सिमोन Keil, Yumi किम, पैट्रिक स्मिथ, काई मथार और Valenzano लैब के सभी सदस्यों को विभिंन पहलुओं में योगदान के लिए बुढ़ापे की जीव विज्ञान के लिए मैक्स प्लैंक संस्थान में धंयवाद वर्तमान killifish के वर्षों में पशुपालन प्रोटोकॉल ।
Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
Cononut fiber | Dragon | ZCS010 | |
Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
Silica sand | local pet shop | ||
Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
Aquatic housing system | Aquaneering | Central filtration equipped aquatic system | |
Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
50mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
15mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
25L Brine shrimps hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
500mL Brine shrimps hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backuo hatcher |
Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
Brine shrimps separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
Parafilm | P-Lab | P701605 | |
Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
1L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
2L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
500mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimps |
120 micron brine shrimps strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimps/bloodworm collection |
Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25 micron |
Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |