Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kontrollierte Produktion von Protein Mikrokristalle. Das Verfahren nutzt ein automatisierte Gerät ermöglicht kontrollierte Manipulation verschiedener Parameter der Kristallisation. Die Protein-Kristallisation ist durch kontrollierte und Automatische Zugabe von Kristallisation Lösungen während der Überwachung und Untersuchung der Radius-Verteilung von Partikeln in der Kristallisation Tropfen durchgeführt.
Das automatisierte Kristallisation-Gerät ist eine patentierte Technik1 speziell für die Überwachung der Protein-Kristallisation-Experimente mit dem Ziel, die Keimbildung und Kristallwachstum zur gewünschten Größen von Proteinkristallen präzise manövrieren. Die kontrollierte Kristallisation basiert auf Probe Untersuchung mit in Situ dynamisches Licht Streuung (DLS), während alle optische Veränderungen in den Tropfen online mit Hilfe eines Mikroskops, gekoppelt mit einer CCD-Kamera, so dass eine vollständige überwacht werden Untersuchung von Protein-Tröpfchen in allen Phasen der Kristallisation. Die Verwendung von in Situ DLS Messungen während des gesamten Experiments ermöglicht eine genaue Identifizierung der hoch übersättigten Proteinlösung Übergang zu einer neuen Phase – die Bildung von Kristall-Kernen. Durch die Identifizierung der Keimbildung Phase Protein, kann die Kristallisation von großen Proteinkristallen für die Produktion von Protein Mikrokristalle optimiert werden. Das experimentelle Protokoll zeigt eine interaktive Kristallisation Ansatz basierend auf präzise automatisierte Schritte wie Fällungsmittel hinaus Wasserverdunstung für induzierende hohe Übersättigung und Probenverdünnung zur Verlangsamung induzierte homogenen Keimbildung oder Rückwärtsfahren Phasenübergänge.
In den letzten Jahren hat das Wachstum von Eiweiß Mikro- und Nanokristalle die Aufmerksamkeit der Proteinkristallographie Gemeinschaft, vor allem mit der kontinuierlichen Entwicklung von seriellen Femtosekunden Kristallographie (SFX) erfasst. Durch die Brillanz der neuartigen Röntgen Strahlung Quellen und basierend auf den erfolgreichen Ergebnissen so weit, die Produktion von Protein Mikro- und Nanokristalle geworden von hoher Relevanz, einem hohen Anspruch an die Vorbereitung von solchen kristalline Suspensionen posiert 2 , 3. aufgrund der kleinen Kristall-Größenbereich benötigt für die Datenerfassung auf freie-Elektronen-Laser (XFELs) und die begrenzte Verfügbarkeit von experimentellen Strahlzeit, Charakterisierung der Probe vor der Datenerhebung ist wichtig. Am häufigsten verwendeten Techniken, Eiweiß Mikro- oder Nanocrystal Suspensionen zu charakterisieren sind bis jetzt Elektronenmikroskopie und Röntgenbeugung Pulver.
Bisher wurden verschiedene Ansätze von gemeinsamen Kristallisation Methoden mit dem Ziel, Masse Mengen von Proteinkristallen mit Abmessungen im Mikrometerbereich kleine produzieren angepasst. Das Batch-Verfahren dient zum schnellen mischen hoch konzentriertes Eiweiß und Fällungsmittel Lösungen, so zwingt die Beispiellösung zu einer hoch übersättigten Phase wo Nanocrystallization favorisierte4sein könnte. Andere Methoden sind die Zerkleinerung von großen Proteinkristallen um ein Kristall-Gülle bilden dienen als nanokristallinen Suspensionen für Daten Sammlung5verwendet werden können. Allerdings könnte die Ergebnisse manchmal verminderte Beugung Qualität führen, da verschlechterte Kristalle untere inneren Ordnung haben. Nanocrystallization basierend auf freie Schnittstelle Diffusion ist auch Alternative zur Verfügung, wo Proteinlösung in kleinen Mengen mit einer hochkonzentrierten Fällungsmittel Lösung3hinzugefügt. Jedoch scheinen unter alle Techniken, die effizientesten Methoden der Batch-Kristallisation und weitere innovative manipulativen Techniken, die mit Dampf-Diffusions-Methoden in Tropfen6sitzen.
Im Allgemeinen muss für Kristallisation eines Proteins eine Energiebarriere gekreuzt werden, um Keimbildung – thermodynamischen zunächst Kristallbildung zu unterstützen. Um die Proteinlösung von einem thermodynamisch stabilen Zustand zu Übersättigung zu bewegen und schließlich um einen Phasenübergang zu induzieren, einige Variablen, die im Zusammenhang mit der Proteinlösung geändert werden müssen. Solche Variablen sind in der Regel die Konzentration der Proteinlösung, Veränderungen der Umwelt (zB., Temperatur, Luftfeuchtigkeit), Lösungsmittel Eigenschaften (z.B., pH, Ionenstärke), Konzentration und Puffer Eigenschaften, etc.7 ,8 eine Übersicht der Probe-Parameter, die geändert werden können ist in der Regel mittels Phasendiagramme, wodurch verschiedene Formen der Präsentation, wie Löslichkeit Diagramme, Keimbildung Phasendiagramme oder noch detailliertere vertreten Beschreibungen, dreidimensionale oder komplexere Diagramme in Erwägung8,9,10kommen können. Die attraktivsten Phase Diagramm-Typen sind in der Regel zweidimensional, wo die wichtigsten Variable ist die Konzentration des Proteins als Funktion der anderen Parameter, während die übrigen Parameter konstant6,11gehalten werden. Sobald eine oder mehrere Kerne gebildet sind, können größere Kristalle wachsen, durch die Aufnahme von zusätzlichen Protein aus der Bulk-Lösung. Wenn Mikro- und Nanocrystal Produktion mit dem Ziel, ist solch ein konventionelle Kristallisation Ansatz nicht möglich mehr aufgrund der geringen Anzahl von Kristallen, die in der Lösung vorhanden sind. Nanokristallinen Suspensionen haben in der Regel reich an kristallinen Einheiten, so sein, dass die Kristallisation Weg hat neu justiert werden, so dass es eine Maxima der Keimbildung Ereignisse in der Probe vorhanden. Dies erfordert in der Folge die Untersuchung einiger neuer, bis jetzt unerforschten Keimbildung Wege für Proteine, die auch noch nicht vollständig verstandenen12,13. Basierend auf den Phase Diagramm Grundlagen erwähnt, die klassische Theorie wurde erweitert um eine neue Hypothese, wo Keimbildung als zweistufigen Mechanismus beschrieben wird: auf den ersten, ein Übergang zu einer höheren Proteinkonzentration erfolgt (Dichte Flüssigkeit Phase) und zweitens einen Übergang von einer dichten-reiche Phase mit einer höheren inneren Ordnung (Kristall Kerne mit Gitter Architektur)14,15,16. Protein-Kristallisation ist empfindlich auf viele Faktoren, und daher bei der Kristallisation Rezepte neu justiert werden, zu verschiedenen großen Kristallen führen, die Rezepte nicht immer auf stützen Vorkenntnisse. Neue Erkenntnisse müssen für jedes einzelne Protein-Ziel festgelegt werden: Anpassung der Puffer Zusammensetzung, Reinheit und Stabilität der Probe, präzise Kenntnisse der Protein Löslichkeit, etc..
Dynamische Lichtstreuung ist heute eine etablierte Methode zur Analyse und Optimierung von Protein Kristallisation Prozessen wegen einem breiten Größenbereich von Teilchen, die untersucht werden können: aus Monomeren Proteinen Nanokristallen und kleine Mikrokristalle. Die Methode nutzt, dass Partikel in Lösung Brownsche Bewegung unterzogen und, dass die durchschnittliche Geschwindigkeit dieser Bewegung von der Partikelgröße, ihre thermische Energie und der Viskosität des Mediums und der partikelgeometrie bestimmt wird. Zunächst wird das flüssige Medium durch eine kohärente Lichtquelle mit dem Einsatz eines Lasers beleuchtet. Durch Partikel gestreute Licht bildet sich ein Interferenzmuster. Weil die Partikel in ständiger Bewegung sind ändert sich das Interferenzmuster auch dauerhaft. Wenn man in eine bestimmte Richtung, können intensitätsschwankungen beobachtet werden. Diese Schwankungen zeigen jetzt die Teilchenbewegung verursacht durch die Brownsche Bewegung. Aus der gemessenen intensitätsschwankungen wird eine Autokorrelationsfunktion (ACF) berechnet. Eine Analyse des ACF geben ein Maß für die Geschwindigkeitsverteilung (genauer gesagt die Diffusionskoeffizienten) von Partikeln und mithilfe der Stokes-Einstein-Gleichung, ist ein Partikel Radius Verteilung17umgebaut. Zusätzlicher Informationen zum DLS-Funktionalität und Funktionsweise finden Sie in verschiedenen Publikationen und Bücher18,19.
Hier wenden wir und beschreiben eine einzigartige automatisierte Kristallisation Gerät, XtalController900, eine verbesserte Version der XtalController Technologie6, gerade für die Überwachung der interaktiven Protein Kristallisation Experimente entwickelt. Diese Technik zeigt ein hohes potential für Identifikation und Verfolgung von Keimbildung Ereignisse in Echtzeit, ermöglicht ein präzises Manövrieren durch die Kristallisation Phasendiagramm. Dieses besondere Kristallisation Verfahren soll Protein Kristallisation erhalten qualitativ hochwertige Eiweiß Mikro- und Nanokristalle, die geeignet sind für Anwendungen unter Verwendung von Mikro-Fokus Synchrotron Röntgenquellen, Elektronenbeugung, optimieren oder SFX.
Die Kristallisation Gerät soll überwachen und manipulieren entscheidenden Parameter während einer Kristallisation Experiments basiert auf einer modifizierten Dampf-Diffusion-Methode. Diese Technik ermöglicht Überwachung und ein Protein Kristallisation bewertungsexperiment auf allen Stufen, so dass der Benutzer die genaue Kenntnis und Kontrolle der Proteinlösung während der Kristallisation Phasendiagramm in Situ DLS Analyse anhand der Probe-Suspension.
Die Kristallisation Vorrichtung umfasst eine experimentelle Kammer (Abbildung 1) verbunden mit einer CCD-Kamera, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Kristallisation Tropfens. Die Kamera wird an ein Mikroskop mit unterschiedlicher Vergrößerung Objektive, Bereitstellung einer maximalen räumlichen Auflösung von ca. 2,5 µm ausgestattet. Der Kern der experimentellen Kammer ist ein Gromer Mikrowaage für die Verfolgung der Entwicklung der das Probengewicht im Laufe der Zeit. Die Kristallisation Vorgehensweise entspricht einem sitzen-Drop Dampf-Diffusions-Experiment, dem Protein Drop in ein silikonisierte Deckglas gebracht wird, die auf die Mikrowaage gelegt wird. Basierend auf Gewichtsveränderungen von Tröpfchen, die durch Fällungsmittel Addition, Wasserzusatz/Ergänzung oder Probe Verdunstung verursacht werden, bietet die Mikrowaage eine präzise Eingabe an einen Algorithmus für sofortige Berechnung der Protein- und Fällungsmittel Konzentration im Laufe der Zeit . Darüber hinaus sind wichtige Kristallisation Parameter wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit präzise überwacht und gesteuert.
Um eine Kristallisation Experiment durchzuführen, verfügt das Gerät über zwei Mikro-Dosiersysteme (kontaktieren Sie kostenlose piezoelektrische Pumpen), die bei einem Picoliter Maßstab für Fällungsmittel und Wasser zusätzlich arbeiten. Durch die Zusammenarbeit mit solch kleinen Mengen an Substanz, die Konzentration Steigungen und das Phänomen der Konvektion innerhalb des tröpfchens Protein minimiert. Die Hauptrolle der piezoelektrischen Pumpen ist die Zugabe von Fällungsmittel oder Wasser, letzteres zum Beispiel als Ersatz für natürliche Verdunstung von der Protein-Tropfen verwendet. Die Mikro-Dosierung-Systeme haben eine Reihe von Features, die den Zusatz eines Stoffes diktieren können. Solche Merkmale sind: die Wiederholrate für das Hinzufügen eines Stoffes, die Anzahl der Tropfen pro Sekunde, die Breite und Höhe des Stoffes Stream Flugbahn usw.hinzugefügt. Darüber hinaus die Position der Pumpen manuell einstellbar ermöglicht dem Benutzer eine genaue Position für die Addition von Stoffen in das Protein Tröpfchen haben.
Die einzigartige Feedback gesteuert Manipulation des Tropfens Kristallisation wird durch in Situ DLS-Daten erreicht, mögliche Änderungen im Protein Oligomere Zustand während des gesamten experimentellen Verfahrens zeigen können. Die Technik ermöglicht die ständige Evaluierung der Partikelgrößenverteilung im Laufe der Zeit so offenbart unbekannte Protein-bezogene Mechanismen. Die DLS-Optik-Ausrüstung befindet sich strategisch unter dem Deckglas-Bereich erlauben den Detektor und Laser Strahl durch das Deckglas und weiter durch das Protein Tröpfchen in einem Wohnort in Situ ; Daher werden nur Änderungen innerhalb des tröpfchens von DLS Weg aufgezeichnet. Um einfache Handhabung ermöglichen, das Gerät verfügt über zwei Öffnungen: eine Haustür für eine optimale Positionierung der Deckglas und einem Deckel, der entfernt werden kann, so dass der Benutzer die Schussposition der Mikro-Dosierung Systeme anpassen kann sowie mit Genauigkeit eine neue Protein-Dro Plet auf das Deckglas.
Die interaktive kristallisationsverfahren mit dem oben genannten Gerät ist eine zuverlässige Technik für Größe-gesteuerten Herstellung von Proteinkristallen. Obwohl viele Kristallisation Methoden derzeit verfügbar sind, ist Mechanismus selbst Insider-Informationen über die Kristallisation nicht leicht erreichbar. Im allgemeinen erlaubt die Anwendung herkömmlicher Kristallisation Methoden nur begrenzte Kontrolle über eine Lösung in der Kristallisation Phasendiagramm, mit nur ein paar Möglichkeiten, seinen Kurs zu ändern, nachdem ein Experiment gestartet wurde. Während der Durchführung einer Kristallisation experimentieren und so eine automatisierte Kristallisation Technologie gepaart mit in Situ DLS, eine große Anwendung ist viel Wissen über Übergänge in das Phasendiagramm gewonnen. Im Allgemeinen sind die Regionen, was zu amorphen Niederschlag und die Induktion von homogenen Keimbildung nahe beieinander im Phasendiagramm. Daher, durch die Manipulation des Kurs eine Kristallisation Tropfens basierend auf Echtzeit-Informationen über die Kornverteilung, ist es möglich, Niederschlag eines Proteins durch schrittweise Anpassung der Kristallisation Bedingungen zur Keimbildung zu vermeiden und Kristallbildung.
Heute gehören viele Bedingungen, Kristallisation Fällungsmittel Lösungen wo Polyethylenglykol (PEG) Derivate weit verbreitet sind. Solche Verbindungen haben in der Regel eine hohe Viskosität, die Schwierigkeiten für pipettieren oder Abgabe besitzen kann. Die vorliegende Fallstudie gelten die Mikro-Dosierung-Systeme, die für das Fällungsmittel Dosierung verwendet werden sehr dünne Kapillaren, die den Zusatz von Picolitre Schritten ermöglichen. Infolgedessen gibt es einige Einschränkungen bei der Arbeit mit hochviskosen Substanzen. Innerhalb einer Serie der letzten Versuche, das System hat positive Ergebnisse mit Hilfe der folgenden PEG-Derivate gegeben: PEG200 50 %, PEG3000 20 %, PEG6000 10 %, PEG800010 %. Obwohl bisher nur die oben genannten Lösungen getestet wurden, enthalten die Micro-Dosiersystemen einen speziellen Heizung Mechanismus, der verwendet werden kann, um die Viskosität einer Lösung zu verringern. Ein weiterer Faktor ist Salzlösungen, die müssen berücksichtigt werden, wenn als Protein Fällungsmittel verwendet. Beim Arbeiten mit hochkonzentrierten Salze kann eine kleine Menge an der Düse des Mikro-Dosiersystem, oberflächliche Blockierung der Mikro-Dosierpumpe während Fällungsmittel Zugabe verursacht kristallisieren; auch wenn eine sehr hohe Relative Luftfeuchtigkeit experimentelle anwesend ist. Um dieses Problem zu überwinden, muss das Experiment auf Eis gelegt werden, so dass das Salz von der Düse entfernt werden kann. Dies könnte erfordern eine besondere Behandlung und Fehler in der Phase des fällungsmittels Zusatz erzeugen könnte.
Basierend auf die wertvollen Informationen, die erreicht werden kann, wenn solche automatisierten Kristallisation Experimente durchführen, kann diese Technik auch auf Studien zur Untersuchung der physikalischen Chemie Aspekte der Protein Kristallisation ausgedehnt werden. Die Keimbildung und Kristall Wachstum Reaktionsgeschwindigkeiten sind kinetische Phänomene abgeleitet und berechnet anhand der Zeitabhängigkeit Informationen aus einem Experiment wie Temperatur, Wachstum der Partikelgröße und Protein dargestellt und Fällungsmittel werden können Konzentration.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erkennen Finanzierung durch die Europäische Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm unter Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-Probe” Grant Agreement Nr. 637295 und unterstützen Sie mit BMBF Grant 05K16GUA, und die “The Hamburg Zentrum für ultraschnelle Imaging – Struktur, Dynamik und Kontrolle der Materie auf atomarer Skala”Exzellenz-Cluster von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG).
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
Soft wipes | KIMTECH Science | ||
XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |