タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

注: プロトコル全体を通して水の添加用マイクロ投与量のシステム、とい Pump0 Pump1 に呼び出される鉛塩法の追加に使用されるマイクロ投与システム間。この実験の結果は、さらに議論・ THM2_micro 結晶と呼ばれるされます。 1. パラメーターとソリューションのセットアップ 16 mL Na 酒石酸溶液 (1.2 M) と 16 mL の蒸留水 0.2 μ m の滅菌注射器フィルターを使用してフィルター処理します。注: Na 酒石酸ソリューションは、結晶成長実験の沈殿のソリューションを表します。 フィルター選択されたソリューション 5 mL で鉛塩法と水のボトルを埋めます。注: ボトル 5 mL の最大容量があります。 実験室のポンプ ホルダーにボトルをマウントします。 次の値にソフトウェアのウィンドウで実験的パラメーターを設定: 温度 20 ° C、相対湿度 20、および溶媒を水で。注:図 2は、ユーザーが温度、相対湿度、溶剤など各パラメーターに適切な値を挿入することができます表示ウィンドウを示しています。ソフトウェアのウィンドウは、添加物なども、いくつかの追加のパラメーターを示しています。これこそが重要な実験のため添加物が沈殿のソリューションに存在します。 実験室の玄関のドアを開け、coverslip キャリアを取り外します。 キャリアのクリーンとシリル coverslip を置き、デバイスにそれを配置します。注: coverslip 2.2 cm のサイズがあります。 1.4 の手順で環境条件を確保するための実験室を閉じます。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 2. マイクロ計量装置の調整 Pump0 を切り替える使用特性を図 3にポンプし、水の流れを作成します。注: 水ストリーム軌道が調整することができますいくつかのポンプ特性に基づいて作成されます。図 3は、主ポンプ特性とこの実験のために使用する最適な値を示しています。 その指定された調整ネジを手動で操作することにより、カバーガラスの中心に向かって位置を目指して水の流れを調整します。Pump0オフを切り替えます。 Pump1 を切り替え、前述手順 2.1 で行う液体ストリームを作成します。Pump0 の固定位置に向かって Pump1 のストリームの位置を調整します。Pump1オフを切り替えます。 新しい使用される coverslip に置き換えるし、きれいに結晶化実験の 1 つ。注: ソフト ワイプは通常結晶化実験で使用されている前に、残留の塵から新しい coverslip のクリーニングの推薦されます。 3. 実験室でタウマチン ドロップの設定 ソフトウェア パッケージを使用して新しい実験ファイルを作成します。実験ファイルに次の情報を入力します: 蛋白質 ( Thaumatococcus danielliiからタウマチン)、蛋白濃度 (14 mg/mL)、鉛塩法 (Na 酒石酸塩)、および沈殿濃度 (1.2 M)。注: この情報は結晶化実験中に鉛塩法とタンパク質濃度の自動計算になります。 ステップ 3.1 からすべての情報を有効にする新しい実験ファイルをロードします。 Pump0 を使用して小さな水ドロップを追加することによって蛋白質液滴の位置をマークします。注: 目的蛋白質のサンプルの配置をランドマークとなる小さな水滴を作成することです。 風袋ゼロに対し、天秤で重量を設定するボタンを押します。注: これは、カバーガラスの重量と 3.3 のステップで作成した小さな水ランドマークによって追加された余分な重量が削除されます。 実験室の上蓋を開くし、水ランドマーク タウマチン液 8 μ L をピペットします。 新しいタウマチン ドロップを登録するには、次の命令に従います。 実験ファイルから初期条件の属性に新しいドロップのボタンを押します。 Const液滴からの水の自然蒸発を補うためにボタンを押します。 タンパク質のドロップで Pump0 を目指して場合 CCD カメラでチェックしてください。水の流れがドロップの外を目指している場合は、Pump0 の位置を調整してください。注: この瞬間からタンパク質液滴に残ります、一定重量タンパク質液滴からの自然な水分蒸発を補償する自動水添加による。温度や湿度などの他のパラメーターと同様に、タンパク質液滴の重量は、表示ウィンドウを使用してリアルタイムで監視できます。実験はここで一時停止することができます。 4. DLその場測定 電源スイッチにDL レーザーし、手動で調整ネジを使用して蛋白質のドロップでレーザ光を配置します。 次の DL パラメーターを入力: 測定期間 (60 s)、2 つの測定の間の待機時間 (10 s)、および測定 (300) の数。注: 最初 30 測定蛋白質安定性チェックのための参照の測定として役立ちます。測定値の残りの部分は、タンパク質液滴の結晶化過程の全体の長さ中の完全な調査となります。 DLS の測定を開始するに開始ボタンを押します。サンプルの品質をチェックするには、DL のグラフィック表現のいずれかを選択します。注: サンプルはモノ-カオリン、ソリューション内の任意の集計なしの高度を表示する必要があります。DLS 結果を示すし、として読むことができます: 半径分布半径ヒストグラム、半径プロット、概要、または概略的なカウント数の強度の測定。 5. サンプル蒸発ステップ 表 1に示されているデータを使用して集計表の蒸発のステップのための条件を入力します。注: 記号「-」列で導入された 2 行目の「モル/率」を表し、水の損失蛋白質液滴から値が「25」を意味する, 液滴体積が 25% の削減に苦しむこと。これは、液滴のタンパク質濃度が 25% 増加することを意味します。 Automボタンを押すことによってサンプルの蒸発のステップをアクティブにします。サンプルの蒸発のステップが完了したら、停止ボタンを押します。 ボタン サンプルの蒸発を停止した後、ドロップを保つにはConstをアクティブにします。 6. 沈殿の追加手順 図 4 の表 2で提供されるデータを使用してのようにスケジュール表に沈殿追加手順のための条件を入力します。注: テーブルの最初の行は、中にソフトウェア計算蛋白質液滴に追加する、鉛塩法の量に基づくタンパク質液滴の自然蒸発速度校正手順を表します。ソフトウェアは、この値を推定し、自動的に次に沈殿添加水の蒸発を補うために Pump0 の撮影頻度を自動的に調整します。 Automボタンを押すことによって沈殿の追加ステップをアクティブにします。注: 鉛塩法の添加はスケジュール表から入力、以下、自動化されたプロセスです。 7. 時間をかけて結晶化液滴の進化を追跡 CCD カメラを用いたタウマチン結晶の外観を確認します。 DLS のグラフィック表現を使用して粒度分布を確認してください。 表示ウィンドウを使用して、重量と実験的パラメーターの進化を確認してください。注: Na 酒石酸ソリューション タンパク質ドロップで 0.74 M の濃度に達すると、液滴が図 7に見られるように、タウマチンの微結晶の豊かなります。 8. 結晶化液滴の回復 パラフィン オイルできれいな標準テラサキ プレートをコートします。 プレートにパラフィン オイル 3 mL を追加します。 プレートの井戸で油カバー プレートのすべての 72 の井戸は、別の角度で優しくプレートの移動によってパラフィン油を分散します。 パラフィン油の過剰を削除するには、プレートに浮かぶ油を注ぐします。 結晶化実験を終わらせるに停止ボタンを押します。結晶化液滴を含むサンプル キャリアを慎重に取り出してください。 ピペットの使用, テラサキ プレートの井戸に結晶化ドロップの 2 μ 因数のボリュームを配置します。注: オイルにおける平板結晶化液滴を回復することによってサンプル定期的にチェックできます安定性と結晶を使って顕微鏡または標準テラサキ プレートで動作する他の DLS 技術のため。