JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

Published: August 14, 2018
doi:
10.3791/57070
, , , , ,
1Xtal Concepts GmbH, 2Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Laboratory for Structural Biology of Infection and Inflammation c/o DESY,University of Hamburg, 3The Hamburg Center for Ultrafast Imaging,University of Hamburg

Summary

Hier presenteren we een protocol voor gecontroleerde productie van eiwitten microcrystals. Het proces maakt gebruik van een automatische inrichting waarmee gecontroleerde manipulatie van verschillende parameters van de kristallisatie. De eiwit kristallisatie is uitgevoerd-out door gecontroleerde en automatische toevoeging van kristallisatie oplossingen terwijl monitoring en onderzoek naar de RADIUS-verdeling van de deeltjes in de kristallisatie druppel.

Abstract

Het geautomatiseerde kristallisatie apparaat is een gepatenteerde techniek1 speciaal ontwikkeld voor het toezicht op eiwit kristallisatie experimenten met het doel om te manoeuvreren juist de nucleatie en kristalgroei naar gewenste maten van eiwit kristallen. De gecontroleerde kristallisatie is gebaseerd op de steekproef onderzoek met in situ dynamische licht verstrooiing (DLS) terwijl alle visuele veranderingen in de druppel online worden gecontroleerd met behulp van een Microscoop gekoppeld aan een CCD-camera, waardoor een volledige onderzoek van de eiwit-droplet tijdens alle fasen van kristallisatie. Het gebruik van in situ DLS metingen gedurende het gehele experiment maakt een nauwkeurige identificatie van de overgang naar een nieuwe fase-de vorming van kristallen kernen zeer oververzadigde eiwit-oplossing. Door het identificeren van het eiwit nucleatie stadium, kan de kristallisatie op de productie van eiwitten microcrystals van grote eiwit kristallen worden geoptimaliseerd. Het experimentele protocol toont een interactieve kristallisatie aanpak gebaseerd op nauwkeurige automatische stappen zoals precipitant toevoeging, water verdamping voor induceren hoge oververzadiging, en monsterverdunning naar vertraagt geïnduceerde homogene nucleatie of het omkeren van faseovergangen.

Introduction

De afgelopen jaren, heeft de groei van eiwit micro- en nanokristallen veroverde de aandacht van de eiwit-kristallografie Gemeenschap, met name met de voortdurende ontwikkeling van seriële femtoseconde kristallografie (SFX). Vanwege de schittering van de roman Röntgen straling bronnen en gebaseerd op de succesvolle resultaten tot nu toe, de productie van eiwitten micro – en nanokristallen geworden van hoge relevantie, een hoge vraag over de voorbereiding van dergelijke kristallijne schorsingen poseren 2 , 3. als gevolg van de kleine kristallen-groottewaaier vereist voor gegevensverzameling op vrije elektron lasers (XFELs) en de beperkte beschikbaarheid van experimentele beamtime, de karakterisering van het monster vóór de verzameling van gegevens is essentieel. De meest voorkomende technieken te karakteriseren eiwit micro- of nanocrystal schorsingen zijn tot nu elektronenmicroscopie en röntgendiffractie poeder.

Tot nu toe zijn verschillende benaderingen van gemeenschappelijk kristallisatie methoden met als doel het produceren van bulk hoeveelheden eiwit kristallen met dimensies in het bereik van kleine micrometer aangepast. De batch-methode wordt gebruikt voor het snel mengen van geconcentreerde eiwitrijk en precipitant oplossingen, dus de oplossing van het monster te dwingen tot een zeer oververzadigde fase waar nanocrystallization favoriete4misschien wel. Andere methoden omvatten breken grote eiwit kristallen te vormen van een crystal drijfmest, die kan dienen als nanocrystalline suspensies worden gebruikt voor data collectie5. Echter de resultaten kunnen soms leiden tot verminderde diffractie kwaliteit, zoals verslechterde kristallen lagere interne orde hebben. Nanocrystallization op basis van gratis interface diffusie is ook alternatief beschikbaar, waar eiwitten oplossing in kleine hoeveelheden wordt toegevoegd aan een sterk geconcentreerde precipitant oplossing3. Echter, onder alle technieken, de meest efficiënte methoden lijken de batch kristallisatie en meer innovatieve manipulatieve technieken met behulp van damp-diffusie methoden in druppels6zit.

In het algemeen, voor de kristallisatie van een eiwit mogen een energie barrière overschreden worden ter ondersteuning van de nucleatie – de eerste thermodynamische stap in de vorming van de kristallen. Om de eiwit-oplossing van een thermodynamisch stabiele staat naar oververzadiging en ten slotte om een fase-overgang, sommige variabelen die verband houden met de oplossing van het eiwit moeten worden aangepast. Dergelijke variabelen zijn meestal de concentratie van de oplossing van het eiwit, veranderingen in het milieu (bv., temperatuur, vochtigheid), oplosmiddelen kenmerken (bijvoorbeeldpH, Ionische sterkte), concentratie en buffer eigenschappen, etc.7 ,8 , een overzicht van de parameters van het monster kan worden gewijzigd is meestal vertegenwoordigd door middel van fase diagrammen, waarmee verschillende modi van presentatie, zoals oplosbaarheid diagrammen, nucleatie fase diagrammen of zelfs meer gedetailleerde beschrijvingen waar driedimensionale of complexere diagrammen in overweging8,9,10 komen kunnen. De meest aansprekende soorten fase diagrammen zijn meestal twee-dimensionale, waar de belangrijkste variabele de eiwitconcentratie als een functie van een andere parameter, is terwijl de overige parameters worden gehouden constant6,11. Zodra één of enkele kernen zijn gevormd, kunnen grotere kristallen groeien door het innemen van extra eiwit uit de bulk-oplossing. Bij het streven voor de productie van micro- en nanocrystal, is een dergelijke aanpak van de conventionele kristallisatie niet haalbaar meer vanwege het kleine aantal kristallen die in oplossing aanwezig zijn. Nanocrystalline schorsingen hebben meestal om rijk te worden in de kristallijnen entiteiten, dus dat de kristallisatie traject moet worden aangepast, zodat er een maxima nucleatie gebeurtenissen aanwezig in het monster. Bijgevolg is hiervoor het onderzoek van een aantal nieuwe, tot nu onontgonnen nucleatie trajecten voor eiwitten, die ook nog niet volledig begrepen12,,13. Op basis van het fase diagram fundamentals eerder vermeld, de klassieke theorie is uitgebreid tot een nieuwe hypothese, waar nucleatie wordt beschreven als een mechanisme in twee fasen: in eerste instantie een overgang naar een hogere concentratie van eiwitten plaatsvindt (dichte vloeibaar fase) en ten tweede, een overgang van een dichte-rijke fase naar een hogere interne orde (crystal kernen met rooster architectuur)14,15,16. Eiwit kristallisatie is gevoelig voor vele factoren, en daarom wanneer kristallisatie recepten zijn aangepast om te resulteren in verschillende grootte kristallen, de recepten niet altijd vertrouwen op voorkennis. Nieuwe inzichten moeten worden vastgesteld voor elke individuele eiwit-doelstelling: aanpassing van de samenstelling van de buffer, de zuiverheid en de stabiliteit van de steekproef, nauwkeurige kennis van eiwit oplosbaarheid, etc.

Dynamische lichtverstrooiing is vandaag een gevestigde methode voor analyse en optimalisatie van eiwit kristallisatie processen, als gevolg van een groot formaat-aantal deeltjes die kunnen worden onderzocht: van monomeer eiwitten nanokristallen en kleine microcrystals. De methode exploiteert dat deeltjes in oplossing Brownse beweging ondergaan en dat de gemiddelde snelheid van deze resolutie wordt bepaald door de grootte van de deeltjes, hun thermische energie en door de viscositeit van het medium en de geometrie van het deeltje. Op het eerste, wordt de vloeistof verlicht door een coherente lichtbron met het gebruik van een laser. De lichtverstrooiing door deeltjes is het vormen van een interferentiepatroon. Omdat de deeltjes in permanente beweging zijn wordt het interferentiepatroon ook permanent gewijzigd. Bij het zoeken in een bepaalde richting, kunnen intensiteit schommelingen worden waargenomen. Deze schommelingen zijn nu de beweging van de deeltjes veroorzaakt door de Brownse beweging zien. Van de gemeten intensiteit schommelingen wordt een autocorrelatiefunctie (ACF) berekend. Een analyse van het ACF krijgt een maatregel voor de distributie van de snelheid (meer precies de diffusie-coëfficiënt) van deeltjes en met behulp van de Stokes-Einstein-vergelijking, wordt omgezet in een deeltje RADIUS-distributie17. Aanvullende informatie met betrekking tot DLS functionaliteit en werkingsprincipe kan worden gevonden in diverse publicaties en boeken18,19.

Hier we toepassen en beschrijven een unieke geautomatiseerde kristallisatie apparaat, de XtalController900, een bijgewerkte versie van de XtalController technologie6, juist ontwikkeld voor monitoring van interactieve eiwit kristallisatie experimenten. Deze techniek geeft een hoog potentieel voor identificatie en volgen van nucleatie gebeurtenissen in real time, waardoor een nauwkeurige manoeuvreren door het fasediagram kristallisatie. Het doel van deze bijzondere kristallisatie-procedure is te optimaliseren eiwit kristallisatie verkrijgen van hoge kwaliteit eiwit micro- en nanokristallen die geschikt zijn voor toepassingen met behulp van micro-gerichte synchrotron X-ray bronnen, elektronendiffractie, of SFX.

Protocol

Opmerking: Gedurende het gehele protocol, het systeem van de micro-dosering gebruikt voor toevoeging van water zal worden verwezen als Pump0 terwijl het systeem van de micro-dosering gebruikt voor toevoeging van neerslaande zal Pump1 worden genoemd. De resultaten van dit experiment worden verder besproken en aangeduid als THM2_micro-kristallen. 1. parameters en oplossing Setup 16 mL nb-tartraatoplossing (1,2 M) en 16 mL gedestilleerd water met behulp van een 0,2 µm steriele injectiespuit filter filteren.Opmerking: De nb-tartraat oplossing vertegenwoordigt de precipitant oplossing voor de kristallisatie-experiment. Vul de neerslaande en waterflessen met 5 mL van de gefilterde oplossingen.Opmerking: De flessen hebben een maximale capaciteit van 5 mL. Monteer de flessen in de pomp houders van de experimentele kamer. De experimentele parameters instellen in het venster software op de volgende waarden: temperatuur 20 ° C, relatieve vochtigheid bij 20 en oplosmiddelen als water.Opmerking: Afbeelding 2 toont het display waar de gebruiker de juiste waarden voor elke parameter zoals oplosmiddel, temperatuur en relatieve vochtigheid kunt invoegen. Het venster software bevat ook enkele extra parameters zoals additieven. Dit is alleen belangrijk voor experimenten waarbij additieven zijn aanwezig in de precipitant oplossing. Openen van de voordeur van de experimentele kamer en verwijder het dekglaasje aan vervoerder. Plaats een dekglaasje schoon en gesiliconiseerd aan op de drager en plaats het terug in het apparaat.Opmerking: Het dekglaasje aan heeft een grootte van 2,2 cm. Sluit de experimentele kamer om de milieuomstandigheden in stap 1.4.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. 2. micro-dosering systemen aanpassing ON Pump0 schakelen met behulp van de belangrijkste kenmerken in Figuur 3 pomp en maken een waterstraal.Opmerking: Het water stroom traject is gemaakt op basis van enkele kenmerken van de pomp die kunnen worden aangepast. Figuur 3 toont de belangrijkste pomp-eigenschappen en de optimale waarden dat moeten worden gebruikt voor dit experiment. De waterstraal die gericht zijn standpunt ten aanzien van het midden van het dekglaasje aan door haar aangewezen stelschroeven handmatig aanpassen. Schakelen uit Pump0. Overschakelen van ON -Pump1 en maak een vloeibare stroom zoals eerder gedaan in stap 2.1. Pas de positie van de stroom van Pump1 naar de positie voor Pump0 vastgesteld. Schakelen uit Pump1. De gebruikte dekglaasje aan vervangen door een nieuw en schoon voor de kristallisatie-experiment.Opmerking: Zachte doekjes zijn meestal aanbevolen voor het reinigen van de nieuwe dekglaasje aan uit residuele stof, voordat het wordt gebruikt in het experiment kristallisatie. 3. het opzetten van een Thaumatine Drop in de experimentele zaal Maak een nieuwe experimentele bestand met behulp van het softwarepakket. Voer de volgende gegevens in het experimentele bestand: eiwit (Thaumatine van Thaumatococcus daniellii), eiwitconcentratie (14 mg/mL), neerslaande (nb-tartraat) en precipitant concentratie (1,2 M).Opmerking: Deze informatie zal dienen voor de geautomatiseerde berekening van de neerslaande en eiwit concentratie tijdens het experiment kristallisatie. Laad de nieuwe experiment bestand als u wilt activeren alle informatie uit stap 3.1. De positie van de eiwit-droplet markeren door het toevoegen van een druppel van de kleine water met behulp van Pump0.Opmerking: Het doel is het creëren van een klein waterdruppel die zal dienen als een mijlpaal waarop de eiwitSteekproef zal worden geplaatst. Druk op de knop tarra het gewicht gegeven door de microbalans op nul instellen.Opmerking: Dit zal het gewicht van het dekglaasje aan en het extra gewicht door de kleine water-landmark gemaakt in stap 3.3 toegevoegd verwijderen. Open het bovendeksel van de experimentele kamer en Pipetteer 8 µL van Thaumatine oplossing op het water landmark. De nieuwe Thaumatine drop registreren door de volgende opdrachten te volgen. Druk op de knop New drop tot het toeschrijven van de initiële voorwaarden op grond van het experimentele bestand. Druk op de knop Const ter compensatie van de natuurlijke verdamping van water van de druppel. Neem contact op met de CCD-camera als Pump0 in de daling van de eiwitten is gericht. Passen de positie van Pump0 als het water stroom is gericht buiten de daling.Opmerking: Vanaf dit moment vanaf, de druppel eiwit blijft op een constant gewicht, door toevoeging van de geautomatiseerde water die natuurlijke water verdamping uit de eiwit-droplet compenseert. Het gewicht van de eiwit-droplet, evenals de andere parameters zoals temperatuur en relatieve vochtigheid kan worden gecontroleerd in real-time met behulp van het venster Eigenschappen voor beeldscherm. Het experiment kan hier worden gepauzeerd. 4. in Situ DLS-metingen Schakelaar op de DLS laser en breng de laserstraal in de daling van de eiwitten door het handmatig met behulp van de aanpassing schroeven. Voer de volgende DLS-parameters: duur van de meting (60 s), wachtende tijd tussen twee metingen (10 s), en aantal metingen (300).Opmerking: De eerste 30 metingen zal dienen als referentiemetingen voor proteïne stabiliteit-check. De rest van de metingen zal dienen als een volledig onderzoek van de eiwit-droplet tijdens de totale duur van de kristallisatie proces. Druk op de knop Start te initiëren de DLS-metingen. Controleer de kwaliteit van het monster door een van de grafische representaties van Distributielijsten te selecteren.Opmerking: Het monster moet een hoge mate van mono-dispersiteit, zonder enige aggregaten in de oplossing weergeven. De DLS-resultaten kunnen worden aangetoond en kan worden gelezen als: RADIUS-distributie, RADIUS-histogram, RADIUS-plot, metingen samenvatting, of als een overzicht van de graaf tarief intensiteit. 5. voorbeeld verdamping stap Voer de criteria voor de stap van de verdamping in de tabel planning met behulp van de gegevens vermeld in tabel 1.Opmerking: Het teken “-” ingevoerd in de kolom “Molarity/Percentage” in de tweede rij vertegenwoordigt een verlies van water van de druppel van eiwitten, terwijl de waarde “25” betekent dat het volume van de druppel een vermindering van 25% zal lijden. Dit betekent dat de eiwitconcentratie van de druppel met 25% zal toenemen. De monster verdamping stap activeren door op de knop Autom. Druk op de knop stoppen wanneer de steekproef verdamping stap is voltooid. Hiermee activeert u de knop Const constant te houden de daling na het stoppen van de verdamping van de steekproef. 6. precipitant toevoeging stap Voer de criteria voor de precipitant toevoeging stap in de tabel planning weergegeven in Figuur 4 met behulp van de gegevens in tabel 2.Opmerking: De eerste rij van de tabel een stap kalibratie, gedurende welke de software berekent de natuurlijke verdampingssnelheid van de eiwit-droplet op basis van de hoeveelheid neerslaande die moet worden toegevoegd aan de eiwit druppel. De software deze waarde extrapoleert en past automatisch de schietpartij frequentie voor Pump0 ter compensatie automatisch de verdamping van het water voor de volgende stap van de precipitant toevoeging. De precipitant toevoeging stap activeren door op de knop Autom.Opmerking: De toevoeging van de neerslaande is een geautomatiseerd proces, na de inbreng van de tabel planning. 7. het bijhouden van de evolutie van de kristallisatie druppel na verloop van tijd Controleer de weergave van de Thaumatine kristallen met behulp van de CCD-camera. Controleer de korrelgrootteverdeling met behulp van de grafische representaties van Distributielijsten. De evolutie van gewicht en experimentele parameters controleren met behulp van het venster Eigenschappen voor beeldscherm.Opmerking: Wanneer de nb-tartraat oplossing een concentratie van 0,74 M in de daling van de eiwitten bereikt, de droplet wordt rijk aan Thaumatine micro-kristallen zoals te zien in Figuur 7. 8. herstel van kristallisatie druppel Jas een schoon standaard Terasaki plaat met paraffineolie. Voeg 3 mL van paraffineolie aan de plaat. Verspreiden de paraffineolie op de putjes van de plaat door zachtjes het verplaatsen van de plaat onder verschillende hoeken, zodat de olie alle 72 putjes van de plaat omvat. Verwijder de overmaat van paraffineolie door gieten uit de olie die op de plaat drijft. Druk op de knop stoppen tot het einde van het experiment kristallisatie. Zorgvuldig Neem uit de steekproef vervoerder met de kristallisatie druppel. Breng een hoeveelheid van 2 µL aliquots van de daling van de kristallisatie in de putjes van de plaat van de Terasaki met behulp van een precisiepipet.Opmerking: Door het herstellen van de kristallisatie druppel in een plaat onder olie, het monster kan periodiek worden geverifieerd voor stabiliteit en groei van de kristallen met behulp van een microscoop of andere DLS-technieken die met standaard Terasaki platen werken.

Representative Results

De resultaten verkregen door DLS metingen tijdens het experiment kristallisatie blijkt een gedetailleerde evolutie van de kromtestralen van de hydrodynamische deeltje wat resulteert in twee belangrijkste deeltje distributie breuken, die zich na verloop van tijd ontwikkelen. In het eerste deel van het experiment, was het monster langzaam verdampt, met het oog op een hogere concentratie van eiwitten. Zoals blijkt uit figuur 5B, was de daling van de eiwitten geconcentreerd uit 14 mg/mL tot 19,5 mg/mL. Gedurende deze tijd, volgens het RADIUS-distributie patroon in figuur 5A, het eiwit blijkt een monomeer gedrag in oplossing met een constante deeltjesgrootte van ongeveer 2,5 nm. Als het monster is verder wordt verdampt, blijft het monomeer eiwit stabiel in oplossing, zonder enige tekenen van denaturatie of monster aggregatie. De toevoeging van precipitant oplossing tot de daling van de eiwitten is onmiddellijk ingeleid na verdamping van het monster en gemarkeerd met een grijs in de RADIUS-distributie patroon en evenwicht curven voor betere visualisatie (Figuur 5). Op basis van de berekeningen die zijn afgeleid van het gewicht van het monster, wordt de Fractie van de gemarkeerde deeltje toegeschreven aan de inleiding van crystal nucleatie, resulterend in een grootte van de straal van ongeveer 200-400 nm. Dit verschijnsel (bekend als nucleatie) is gestart met een precipitant gehalte van 0,6 M in de eiwit-droplet, op een periode van ongeveer 66 min na de opening van het experiment en ongeveer 23 min met betrekking tot de opening van de neerslaande toevoeging. Als de concentratie van de verhogingen van de precipitant toont de verdeling van RADIUS-een brede verspreiding van deeltjes in oplossing. Zoals meer kernen vormen, de eerste kristallijne entiteiten groeien in omvang, het bereiken van een RADIUS-verdeling tussen 800-1300 nm. Geconcludeerd kan worden dat in dit stadium, de crystal-kernen blijven groeien, en de eiwitoplossing is geleidelijk steeds armer zoals de eiwitmolecules zijn genomen-up door microcrystals. Aangezien de precipitant concentratie in de daling van de eiwitten langzaam stijgt, is de vorming van microcrystals gemakkelijk geïdentificeerd na 75 min, wanneer de RADIUS-distributie verder te ontwikkelen tussen 500 en 1500 nm. De evolutie van de RADIUS-verdeling wordt tevens bevestigd door CCD camera’s, waar de eiwit microcrystals zichtbaar bij een precipitant concentratie van 0,7 M in oplossing (Figuur 7 zijn). Aangezien de precipitant toevoeging is voltooid en de daling van de kristallisatie constant wordt gehouden, toont de verdeling van RADIUS-een overheersende fase tussen 1000 en 3000 nm, terwijl de breuk van nucleatie gebeurtenissen vermindert na verloop van tijd. Op dit moment, de daling van de kristallisatie is volledig verzadigd met microcrystals en geen verdere nucleatie gebeurtenissen in oplossing aanwezig zijn. De gegevens van de feedback gegeven door de microbalans als experimentele input gebruikt, was een fasediagram kristallisatie getekend voor een grondig inzicht in de Thaumatine kristallisatie proces. In Figuur 6, de experimentele fasediagram ziet u drie onafhankelijke kristallisatie experimenten, waar de productie van Thaumatine T. danielli microcrystals wordt aangeduid als THM_2 Micro-kristallen (Protocol). Twee extra kristallisatie experimenten gelabelde THM_1 Macro-kristallen en THM_3 Macro-kristallen werden gebruikt als gegevens invoeren om een juiste toewijzing van de verschillende gebieden in het fasediagram (bv., oplosbaarheid of metastabiele regio). Aangezien de protocollen voor deze experimenten verschillende kristallisatie trajecten volgen, wordt de identificatie van de nucleatie regio gemakkelijker, en dus nauwkeuriger. Voor elk experiment, is de kristallisatie pad gemarkeerd door nummers van orde om te benadrukken van de verschillende benaderingen en aantal kristallisatie stappen die werden gebruikt voor een specifieke uitkomst, terwijl de grijze pijlen staan voor een schatting van de uiteindelijke proteïne concentratie wanneer kristalmoleculen groei uptakes eiwit van de oplossing in de vorming van welomschreven stabiele eiwit kristallen. De drie Thaumatine experimenten gepresenteerd in Figuur 6 tonen verschillende voorwaarden bij het invoeren van de nucleatie regio, en dus verschillende definitieve kristallisatie resultaten als het kunnen worden gezien van de foto’s hieronder het fasediagram. In het geval van THM1 en THM3, het eiwit oplossing passeert de nucleatie fase en opnieuw treedt de metastabiele regio, waar het rust tot kristallen vormen. Bijgevolg leiden de experimenten tot grote, duidelijk afgebakende gevormde kristallen die worden omgeven door moeder drank. Echter voor het experiment gepresenteerd in de sectie protocol, THM2_micro-kristallen, volgt het kristallisatie pad een bepaalde benadering. In de vorige sectie vermeldden wij dat voor een voorbeeld te geven van microcrystals, het eiwit oplossing worden ligt diep in de nucleatie fase, moet zodat de nucleatie gebeurtenissen met een maximale snelheid vormen kunnen. In het geval van THM2_micro-kristallen, de verhouding van eiwit precipitant concentratie werd aangepast op zo’n manier dat het monster niet alleen de nucleatie regio komt, maar als een neerslaande verder aan de oplossing van het eiwit wordt toegevoegd, en de voorwaarden niet naar verplaatsen een andere regio in het fasediagram, maar blijven in een zeer oververzadigde staat binnen de nucleatie regio. Dientengevolge, vermindert de entropie van de oplossing drastisch als de eiwit-droplet verzadigd onmiddellijk met kleine kristallijne entiteiten. Figuur 1. Schematische weergave van het experiment kristallisatie. De tekening geeft een overzicht van de kristallisatie experimentele kamer met alle technische onderdelen die nodig zijn voor het uitvoeren van een experiment geautomatiseerde kristallisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Software venster voor Distributielijsten en monster parameters die relevant voor een experiment kristallisatie zijn. Parameters omvatten temperatuur, relatieve vochtigheid, viscositeit, enz. Figuur 3: venster van het besturingselement van de Software voor de micro-dosering systemen die betrokken zijn bij het experiment kristallisatie. Het bevat functies waarmee aanpassing van specifieke parameters voor de generatie van druppels of oplossing stream. Figuur 4: Software venster voor de tabel van de planning de kristallisatie stappen betrokken bij het experiment beschrijven. De oorspronkelijke voorwaarden van de kristallisatie druppel zijn ook geïntegreerd in dit venster. Figuur 5. Overzicht van Thaumatine T. daniellii microcrystals productie. (A) RADIUS-verdeling van de deeltjesgrootte in de daling van de eiwitten tijdens de gehele kristallisatie proces. (B) gecontroleerde overzicht van experimentele parameters. De percelen vertegenwoordigen de evolutie in de tijd voor het gewicht van de eiwit-droplet (zwarte kromme) samen met de berekende eiwitconcentratie (rode curve) en de precipitant concentratie (blauwe curve). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: Experimental kristallisatie fasediagram voor Thaumatine T. danielli samen met de daaruit voortvloeiende resultaten. Alle percelen worden afgeleid uit experimentele gegevens, gebaseerd op de feedback-informatie gegeven door de microbalans. De getallen toegeschreven aan elk experiment dat zichtbaar tussen haakjes zijn geven de volgorde en het aantal stappen genomen tijdens een kristallisatie-protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7: opgenomen foto voor THM2_Micro-kristallen (Protocol) weergegeven: een overvloedig getal van microcrystals in de oplossing verzadigd. De foto is genomen op 4 h (240 min) na het instellen van de eiwit-druppel in de experimentele zaal voor kristallisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 8: opgenomen foto voor THM_1 Macro-kristallen tonen een paar grote Thaumatine kristallen in oplossing stabiel. De foto werd genomen 20 h na het instellen van de eiwit-druppel in de experimentele zaal voor kristallisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 9: opgenomen foto voor THM_3 Macro-kristallen tonen van verschillende maten van Thaumatine kristallen in oplossing. De foto werd genomen 20 h na het instellen van de eiwit-druppel in de experimentele zaal voor kristallisatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Stof Molarity/Percentage Tijd (s) water 0 100 water -25 2100 water 0 2100 Tabel 1: Geautomatiseerde planning input voor de steekproef verdamping stap in de productie van Thaumatine microcrystals. Stof Molarity/Percentage Tijd (s) water 0 100 prec 0.8 1800 water 0 18000 Tabel 2: geautomatiseerde planning ingang voor de precipitant toevoeging stap in de productie van Thaumatine microcrystals.

Discussion

De kristallisatie apparaat is ontworpen om te controleren en manipuleren van cruciale parameters tijdens een experiment van de kristallisatie op basis van een gewijzigde damp-diffusie-methode. Deze techniek maakt het mogelijk toezicht en scoren een eiwit kristallisatie experiment in alle stadia, waardoor de gebruiker om nauwkeurige kennis en controle van de eiwit-oplossing gedurende de kristallisatie fasediagram, op basis van in situ DLS analyse van de schorsing van de steekproef.

De kristallisatie apparaat bestaat uit een experimentele kamer (Figuur 1) aangesloten op een CCD camera waarmee real-time bewaking van de druppel kristallisatie. De camera is aangepast aan een microscoop voorzien van verschillende vergroting lenzen, bieden een maximale ruimtelijke resolutie van ongeveer 2,5 µm. De kern van de experimentele kamer is een ultrasensitive microbalans voor het bijhouden van de evolutie van het gewicht van het monster na verloop van tijd. De kristallisatie procedure komt overeen met een vergadering neerzetten damp-diffusie experiment, waar de daling van de eiwitten in een gesiliconiseerd dekglaasje aan, die wordt geplaatst op de microbalans wordt gebracht. Op basis van veranderingen in het lichaamsgewicht van de druppel, die worden veroorzaakt door precipitant optellen, water/additief toevoeging of voorbeeld verdamping, geeft de microbalans een nauwkeurige ingang aan een algoritme voor onmiddellijke berekening van eiwitten en neerslaande concentratie na verloop van tijd . Daarnaast zijn belangrijke kristallisatie parameters zoals temperatuur en relatieve vochtigheid juist bewaakt en gecontroleerd.

Om een kristallisatie experiment, is het apparaat uitgerust met twee micro-dosering systemen (Neem contact op met gratis piëzo-elektrische pompen) die op een schaal picoliter voor toevoeging van de neerslaande en water werken. Door samen te werken met zulke kleine hoeveelheden van stof, zijn de concentratie verlopen en het fenomeen van de convectie in de eiwit-droplet geminimaliseerd. De belangrijkste rol van de piëzo-elektrische pompen is de toevoeging van de neerslaande of water, de laatste bijvoorbeeld als compensatie voor de natuurlijke verdamping van de eiwit-droplet wordt gebruikt. De micro-dosering systemen hebben een reeks van functies, die de toevoeging van een stof kunt dicteren. Deze functies omvatten: de herhaling tarief voor het toevoegen van een stof, het aantal druppels toegevoegd per seconde, de breedte en de hoogte van de stof stream traject, enz. Bovendien, de positie van de pompen kan handmatig worden aangepast, waardoor de gebruiker om een exacte positie voor toevoeging van stoffen in de eiwit-druppel.

De unieke feedback gecontroleerd manipulatie van de daling van de kristallisatie wordt bereikt door in situ DLS gegevens, die mogelijke veranderingen in de eiwitten oligomere staat gedurende de hele experimentele procedure kunt weergeven. De techniek maakt het mogelijk permanente evaluatie van korrelgrootteverdeling na verloop van tijd, dus het openbaren van onbekende proteïne-gerelateerde mechanismen. De apparatuur van de optica DLS is geplaatst strategisch onder het dekglaasje aan gebied, waardoor de detector en laser beam passeren het dekglaasje aan en verder via de eiwit druppel in een mode in situ ; Daarom worden alleen wijzigingen binnen de droplet geregistreerd vanaf de DLS-pad. Om gemakkelijk te hanteren, het apparaat heeft twee openingen: een voordeur voor een optimale plaatsing van het dekglaasje aan en een bovendeksel die kan worden verwijderd, zodat de gebruiker kan het aanpassen van de schietpartij positie van de micro-dosering systemen evenals instellen met nauwkeurigheid een nieuwe eiwit dro Plet op het dekglaasje aan.

De interactieve kristallisatie-methode met behulp van de bovengenoemde apparaat is een betrouwbare techniek voor grootte-gecontroleerde productie van eiwitten kristallen. Hoewel vele kristallisatie methoden die momenteel beschikbaar zijn, gedetailleerde informatie over de kristallisatie is mechanisme zelf niet gemakkelijk haalbaar. In het algemeen, kan conventionele kristallisatie methoden toe te passen slechts beperkte controle op een oplossing in het fasediagram kristallisatie, met slechts een paar mogelijkheden van zijn cursus veranderen zodra een experiment is begonnen. Tijdens het uitvoeren van een kristallisatie experimenteren en toepassing van een dergelijke geautomatiseerde kristallisatie technologie in combinatie met in situ DLS, een grote hoeveelheid kennis is opgedaan over de overgangen in het fasediagram. In het algemeen, liggen de regio’s wat resulteert in amorfe neerslag en de inductie van homogene nucleatie dicht bij elkaar in het fasediagram. Daarom door het manipuleren van de loop van een druppel van de kristallisatie op basis van real-time informatie over de verdeling van de deeltjes, is het mogelijk om te voorkomen dat neerslag van een eiwit door de kristallisatie voorwaarden naar nucleatie geleidelijk aan te passen en kristal vorming.

Tegenwoordig omvatten veel kristallisatie voorwaarden precipitant oplossingen waar polyethyleenglycol (PEG) derivaten alom aanwezig zijn. Dergelijke verbindingen hebben meestal een hoge viscositeit die moeilijkheden voor pipetteren of verstrekking kan bezitten. In de huidige case study toepassing de micro-dosering systemen die worden gebruikt voor de verstrekking van precipitant zeer dunne haarvaten, die de toevoeging van picolitre stappen mogelijk te maken. Dientengevolge, zijn er enkele beperkingen bij het werken met zeer viskeuze stoffen. Binnen een reeks van afgelopen experimenten, heeft het systeem positieve resultaten met behulp van de volgende PEG derivaten gegeven: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10% PEG800010%. Hoewel tot nu toe alleen de bovengenoemde oplossingen werden getest, bevatten de micro-dosering systemen een speciale verwarming-mechanisme dat kan worden gebruikt ter vermindering van de viscositeit van een oplossing. Een andere factor is zout oplossingen die worden overwogen moeten wanneer gebruikt als eiwit precipitant. Wanneer u werkt met sterk geconcentreerde zouten, kunt een klein bedrag kristalliseren op het mondstuk van de micro-doseringssysteem, waardoor oppervlakkige blokkeren van de micro-dosering pomp tijdens precipitant toevoeging; zelfs wanneer een zeer hoge relatieve vochtigheid is in de experimentele vergaderzaal aanwezig. Om dit probleem te overwinnen, moet het experiment in de wachtstand worden geplaatst, zodat het zout van de verstuiver kan worden verwijderd. Dit wellicht speciale behandeling en fouten in de precipitant toevoeging fase zouden kunnen produceren.

Op basis van de waardevolle informatie die kan worden bereikt bij het uitvoeren van dergelijke geautomatiseerde kristallisatie experimenten, kan deze techniek ook worden uitgebreid tot studies onderzoeken van de aspecten van de fysische chemie van eiwit kristallisatie. De nucleatie en kristal reactie groeicijfers zijn kinetische verschijnselen die kunnen worden afgeleid en berekend op basis van de informatie van de tijdafhankelijkheid afgebeeld van een experiment zoals temperatuur, groei van deeltjesgrootte en eiwit en precipitant concentratie.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen financiering uit de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder de Marie Sklodowska-Curie Acronym “X-Probe” Grant overeenkomst No. 637295 en ondersteuning via goedgekeurd subsidie 05K16GUA, en de “The Hamburg Centrum voor ultrasnelle Imaging-structuur, dynamiek en controle van kwestie op de atoomschaal”excellentie cluster van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

Materials

Thaumatin from Thaumatococcus daniellii Sigma-Aldrich 1002365940 Protein for protocol
Bis-Tris 14880 Sigma-Aldrich 2302377 Buffer for protein solution
di-Sodium tartrate dihydrate AppliChem A0451,0500 Precipitant for protein solution
Silliconized coverslips Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1051203 Coverslips for crystallization
Syringe filter Starstedt 831826001 Filter pore 0.2 µm
Syringe Omnifix 4617207V Luer Lock Solo 20 mL
Paraffin oil Sigma-Aldrich 2323842 Oil for coating the plate
Standard Terakasi plate Sigma-Aldrich M5812270EA Plate for recovering the crystallization droplet
Soft wipes KIMTECH Science
XtalController900 Xtal-Concepts GmbH XTC900 Crystallization device
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. . . Patent “Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation”. , (2010).
  2. Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
  5. Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
  6. Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
  7. Ferré-D’Amaré, A. R. . Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), 847-848 (1999).
  8. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  9. Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
  10. Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
  11. Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
  12. McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
  13. Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
  14. Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
  15. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
  16. Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
  17. Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
  18. Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
  19. Brown, W. . Dynamic light scattering: the method and some applications. , 978 (1993).

Tags

Protein CrystallizationDynamic Light ScatteringIn Situ MonitoringAutomated CrystallizationCrystal GrowthNano/micro-crystalsThaumatinSodium Tartrate

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Baitan, D., Schubert, R., Meyer, A., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering. J. Vis. Exp. (138), e57070, doi:10.3791/57070 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image