Évaluation de la fonction vésiculaire extracellulaire au cours de l’Infection palustre

Selon l’Organisation mondiale de la santé, il y a 212 millions de nouveaux cas de paludisme dans le monde en 2015 et environ 429 000 personnes sont mortes, principalement des enfants moins de cinq ans d’âge¹. Les mécanismes conduisant à une maladie grave, qui est souvent associée à une dysfonction vasculaire, restent mal définis². Plasmodium– iRBCs sécrètent des sphères petit bi-lipides membranaires appelées vésicules extracellulaires (EVs). On sait que ces véhicules électriques sont susceptibles d’être pertinents pour le processus d’infection et de la réponse immunitaire de hôte à l’infection ; Cependant, on connaît la fonction exacte de ces petites vésicules au cours de l’ infection de paludisme³. Il est possible qu’ils jouent deux rôles importants : d’une part, ils pourraient contribuer à la pathogenèse en activant des macrophages^4,5; et d’autre part, ils pourraient agir comme médiateur communication cellulaire entre les parasites et entre les parasites et hôte^6,7. En fait, parasites peuvent transférer des protéines ou des acides nucléiques entre eux via EVs. Par exemple, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs peut transférer le facteur de virulence Serum Resistance-Associated (SRA) et peut également cibler les autres T. brucei et hôte érythrocytes⁸. En outre, à P. falciparum– iRBCs communiquer entre eux par le transfert d’acides nucléiques dans les véhicules électriques. Cela permet les parasites d’optimiser et de synchroniser sa croissance. En fait, les EVs pourraient être le principal régulateur de la conversion gamétocyte et donc contribuer à la régulation de la transmission Etape⁷.

Non seulement EVs réglementent les parasites, ils véhiculent aussi des interactions hôte-parasite. Nous avons récemment découvert que EVs d’iRBCs contiennent des dérivés hôte le microARN (miARN ; petites espèces d’ARN dans la fourchette de 21 à 25 nucléotides⁹) qui était absorbés par les cellules endothéliales humaines. Les miARN du serveur virtuel Exchange forme un complexe avec Ago2 stable (membre de la RNA-induced silencing complex), qui, une fois livré à des cellules réceptrices, est capable de plus précisément faire taire l’expression des gènes et qui affectent les propriétés barrières des cellules¹⁰. Protocoles standards ont été développés pour étudier la fonction du SVE. Nous décrivons ici tout d’abord un protocole qui permet le marquage fluorescent de EVs pour enquêter sur leur absorption par les cellules réceptrices. En outre, en utilisant un microscope confocal, il est possible de suivre le sort de l’EV à l’intérieur de la cellule. Plusieurs colorants fluorescents peuvent être utilisés pour suivre les EVs. Le colorant réactif-amine, 5-(and-6)-carboxyfluorescéine diacétate Succinimidyl Ester (CFSE) et fluorescentes de calcéine-AM deviennent une fois à l’intérieur des vésicules. Nous préférons utiliser le label amphiphiles, PKH, parce qu’il donne un signal plus lumineux et plus uniform. Cette approche fournit des informations importantes pour comprendre les interactions entre les véhicules électriques et de cellules réceptrices. Tandis que dans certains cas, EVs se lient à la surface des cellules, des vésicules sont rapidement absorbés. Après absorption, EVs livrent leur cargaison aux cellules, dans lequel ils exercent leurs fonctions de réglementation.

Nous décrivons ici un protocole visant à mesurer la fonction barrière de la cellules endothéliales in vitro en quantifiant le transfert d’un dextran fluorescent à travers une couche cellulaire. Traceurs plus sensibles peuvent être utilisées comme marqueurs radioactifs. Toutefois, dont ils ont besoin de précautions spéciales pour utilisation. Autres tests existent pour mesurer la fonction de barrière en vitro telles que la résistance électrique transendothéliale (TEER), qui mesure l’intégrité de la jonction serrée. Enfin les visualisation ZO-1, une protéine de jonction serrée, par immunofluorescence permet d’évaluer de l’intégrité de la jonction serrée comme bien¹⁰. EVs étant des entités complexes et hétérogènes contenant plusieurs cargaisons avec caractéristiques réglementaires potentielles, il est utile de surexprimer un ARN spécifique pour étudier ses effets sur la cellule receveuse. Par conséquent, nous définissons également un protocole qui vise à produire des lignées cellulaires stables exprimant la miRNA d’intérêt¹⁰.