Summary

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Published: February 14, 2018
doi:

Summary

في هذا العمل، ويصف لنا بروتوكولات التحقيق في دور حويصلات خارج الخلية (EVs) صدر عن الكريات الحمراء المنجلية المصابة. على وجه الخصوص، نحن نركز على تفاعلات المركبات الكهربائية مع خلايا بطانية.

Abstract

الملاريا ومرض يهدد الحياة الناجمة عن الطفيليات المتصورة ، و المنجلية الأكثر انتشارا في القارة الأفريقية والمسؤولة عن معظم الوفيات المرتبطة بالملاريا على الصعيد العالمي. العديد من العوامل بما في ذلك عزل الطفيلي في الأنسجة، والخلل في الأوعية الدموية، والاستجابات التهابات تؤثر على تطور المرض في الأشخاص المصابين بالملاريا. المنجلية-خلايا الدم الحمراء المصابة (إيربكس) إطلاق سراح حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) التي تحتوي على أنواع مختلفة من جزيئات الشحنات التي تتوسط الاتصال المرضية والخلوية بين الطفيليات والمضيف. المركبات الكهربائية هي كفاءة تناول الخلايا التي كانت تعدل وظيفتها. هنا نناقش استراتيجيات لمعالجة دور المركبات الكهربائية في تفاعلات الطفيلي المضيف. أولاً، نحن تصف طريقة واضحة لوضع العلامات وتعقب تدخيل EV بخلايا بطانية، استخدام صبغة رابط خلية خضراء. ونحن التقرير الثاني، طريقة بسيطة لقياس النفاذية عبر أحادي الطبقة غشائي خلية باستخدام ديكستران مسمى فلوريسسينتلي. وأخيراً، نعرض كيفية التحقيق في دور جزيئات الحمض النووي الريبي غير الترميز صغيرة في وظيفة الخلايا البطانية.

Introduction

ووفقا “منظمة الصحة العالمية”، كانت هناك 212 مليون حالة جديدة من الملاريا في جميع أنحاء العالم بحلول عام 2015 وتوفي حوالي 429,000 شخصا، معظمهم من الأطفال دون سن الخامسة من العمر1. الآليات التي تؤدي إلى المرض الشديد، الذي يرتبط غالباً بالخلل في الأوعية الدموية، ما زالت غير محددة2. تفرز المتصورة-إيربكس صغيرة ثنائية-دهن غشاء المجالات المعروفة باسم حويصلات خارج الخلية (EVs). ومن المعروف أن هذه المركبات الكهربائية التي يحتمل أن تكون ذات الصلة بعملية العدوى والمضيف الاستجابة المناعية للعدوى؛ ومع ذلك، يعرف الكثير عن الدالة exact لهذه الحويصلات الصغيرة أثناء الإصابة بالملاريا3. فمن الممكن أنها تلعب دورين هامين: من ناحية، أنها قد تسهم في التسبب بتفعيل الضامة4،5؛ ومن ناحية أخرى، قد توفق الاتصالات الخلوية بين الطفيليات والطفيليات والمضيف6،7. وفي الواقع، يمكن نقل الطفيليات البروتينات أو الأحماض النووية بين بعضها البعض عن طريق المركبات الكهربائية. على سبيل المثال، المثقبيات البروسية rhodesiense المركبات الكهربائية يمكن نقل عامل فوعة Serum Resistance-Associated (SRA)، ويمكن أن تستهدف الكريات الحمراء المضيفة و البروسية ت أخرى8. وعلاوة على ذلك، المنجلية-إيربكس الاتصال بين بعضها البعض من خلال نقل الأحماض النووية داخل المركبات الكهربائية. وهذا ما يسمح الطفيليات على الوجه الأمثل، وتزامن نموه. في الواقع، قد تكون الجهة الرئيسية المنظمة للتحويل جاميتوسيتي المركبات الكهربائية، وبالتالي المساهمة في تنظيم مرحلة انتقال7.

ليس فقط القيام بتنظيم المركبات الكهربائية الطفيليات، وأنها تتوسط أيضا تفاعلات الطفيلي المضيف. اكتشفنا مؤخرا أن المركبات الكهربائية من إيربكس تحتوي على المستمدة من المضيف ميكرورناس (ميرناس؛ والأنواع الصغيرة من الحمض النووي الريبي في النطاق من 21-25 النيوكليوتيدات9) التي تم تناولها بالخلايا البطانية البشرية. ميرناس في المركبات الكهربائية شكل مستقر معقدة مع Ago2 (عضو لإسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي معقدة)، التي بمجرد تسليمها إلى الخلايا المتلقية، وهو قادر على إسكات الجينات على وجه التحديد والتي تؤثر على خصائص الخلايا10الحاجز. وقد وضعت البروتوكولات القياسية للتحقيق في وظيفة المركبات الكهربائية. وهنا يصف لنا أولاً بروتوكول يسمح للعلامات الفلورية للمركبات الكهربائية للتحقيق على امتصاص الخلايا المتلقية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مجهر [كنفوكل]، من الممكن تتبع مصير EV داخل الخلية. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية لتعقب المركبات الكهربائية. صبغ أمين المتفاعلة واستر اسيتات-(and-6)-كاربوكسيفلوريسسين 5 سوكسينيميديل (CFSE) ونيون كالسين-صباحا تصبح مرة واحدة داخل الحويصلات. نحن نفضل استخدام التسمية أمفيفيليك، بخ، لأنه يعطي إشارة أكثر إشراقا وأكثر توحيدا. هذا النهج يوفر معلومات هامة فهم التفاعلات بين المركبات الكهربائية والخلايا المتلقية. بينما في بعض الحالات ربط المركبات الكهربائية على سطح الخلايا، سرعة قصرت بعض الحويصلات. عند امتصاص، يسلم المركبات الكهربائية على الشحنات إلى الخلايا، التي كانت تمارس مهامها التنظيمية.

هنا، يمكننا وصف بروتوكولا لقياس وظيفة حاجز غشائي الخلايا في المختبر بالتحديد الكمي لنقل ديكستران الفلورسنت من خلال أحادي الطبقة خلوية. ويمكن استخدام تتبع أكثر حساسية مثل علامات راديولابيليد. ومع ذلك، أنها تتطلب احتياطات سلامة خاصة للاستخدام. توجد فحوصات أخرى لقياس وظيفة الحاجز في المختبر مثل المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال (طير)، الذي يقيس سلامة مفرق ضيق. وأخيراً تصور زوي-1، بروتين مفرق ضيق، قبل الفلورة يسمح تقييم سلامة مفرق ضيق ك جيدا10. وبالمركبات الكهربائية كيانات معقدة وغير متجانسة تحتوي على شحنات عدة مع الخصائص التنظيمية المحتملة، من المفيد أوفيريكسبريس الحمض النووي الريبي محددة لدراسة تأثيرها على الخلية المتلقية. ولذلك، نحن أيضا تعريف بروتوكول الذي يهدف إلى إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن ميرنا لفائدة10.

Protocol

وتم الحصول على كرات الدم الحمراء البشرية من دم المانحين صحي، وفقا للمبادئ توجيهية سويسيثيكس (swissethics.ch). ملاحظة: الإنتاج EV و المنجلية الطفيلي الثقافات (3 7) وصفت سابقا في مباجوو، وآخرون. 11 لأن المنجلية هو مسببات الأمراض بشرية، استشارة اللوائح المحلي?…

Representative Results

هنا، يمكننا وصف بروتوكولات للتحقيق في تفاعلات المركبات الكهربائية مع الخلايا المضيفة. ويرصد الإقبال على المركبات الكهربائية المسمى فلوريسسينتلي المجهري [كنفوكل] (الشكل 1). خلايا بطانية كفاءة تناول المركبات الكهربائية، لكن وقت الحضانة مع المركبات الكهرب…

Discussion

الطفيليات عدة، بما في ذلك التوكسوبلازما ومثقبيه ليشمانيا المشعرة يؤدي إلى الإفراج عن المركبات الكهربائية بالخلية المضيفة المصابة. اعتماداً على مسببات الأمراض، يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية المضيف EVs المفرج عنهم أو التوسط في الاتصالات الخلوية بين الطفيليات6. حتى الآن، هنا…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذه الدراسة كان دعم مالي في جزء من مؤسسة نوفارتيس الطبية-والبحوث البيولوجية (ليم) غوتفريد وجوليا بانجتر-رهينير-ستيفتونغ (إلى ميغاواط ويم) ومجمع البحوث جامعة فريبورغ (ليم). منح إضافية تشمل “المنح الحكومة السويسرية على التميز” “الباحثين الأجانب” (لكاب و SM). ونحن نشكر سولانج كروبي هيس وفلي إيزابيل للدعم التقني.

Materials

PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher – Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

Referências

  1. WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

View Video