आनुवंशिक कोड विस्तार प्रोटीन acetylation सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए इस तकनीक का दोहन करने के लिए विशिष्ट साइटों में homogeneously acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए ई कोलाई कोशिकाओं.
प्रोटीन के विशिष्ट पदों पर होने वाले पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है । उनमें से, प्रतिवर्ती lysine acetylation सबसे व्यापक रूप से जीवन के सभी डोमेन में वितरित में से एक है । हालांकि कई मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित acetylome अध्ययन किया गया है, इन ख्यात acetylation लक्ष्य के आगे लक्षण वर्णन सीमित किया गया है । एक संभावित कारण यह है कि यह सबसे क्लासिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण से वांछित पदों पर विशुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन उत्पंन करने के लिए मुश्किल है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, आनुवंशिक कोड विस्तार तकनीक को एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase वैरिएंट की जोड़ी का उपयोग करने के लिए लागू किया गया है, और इसके cognate tRNA से Methanosarcinaceae प्रजातियों, cotranslational को प्रत्यक्ष करने के लिए ब्याज की प्रोटीन में विशिष्ट साइट पर acetyllysine की । citrullinated acetylation के अध्ययन में पहले आवेदन के बाद, इस दृष्टिकोण प्रोटीन की एक किस्म पर acetylation अध्ययन की सुविधा है । इस काम में, हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन के लिए साइट का उत्पादन विशेष रूप से acetylated प्रोटीन मॉडल जीवाणु मेजबान के रूप में ई कोलाई का उपयोग करके । Malate डिहाइड्रोजनेज इस काम में एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) अनुवाद प्रक्रिया के बाद होते हैं, और कार्यात्मक समूहों के एमिनो एसिड अवशेषों को आबंध अलावा से उठता है, लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, जीन सहित प्रतिलेखन, तनाव प्रतिक्रिया, सेलुलर भेदभाव, और चयापचय1,2,3। तिथि करने के लिए, के बारे में ४०० विशिष्ट PTMs की पहचान की गई है4। जीनोम और proteome के intricacy प्रोटीन PTMs द्वारा एक काफी हद तक परिलक्षित है, के रूप में वे प्रोटीन गतिविधि और स्थानीयकरण को विनियमित, और प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, लिपिड, और cofactors के रूप में अंय अणुओं के साथ बातचीत को प्रभावित5।
प्रोटीन acetylation पिछले दो दशकों6,7,8,9,10,11,12में PTMs अध्ययन में सबसे आगे रहा है । Lysine acetylation पहले histones में अधिक से अधिक ५० साल पहले की खोज की थी13,14, अच्छी तरह से छानबीन किया गया है, और अधिक से अधिक ८० प्रतिलेखन कारकों, नियामकों में अस्तित्व में जाना जाता है, और विभिंन प्रोटीन15, 16,17. प्रोटीन acetylation पर अध्ययन न केवल हमें अपने विनियामक तंत्र की गहरी समझ के साथ प्रदान की है, लेकिन यह भी बेकार acetylation की वजह से रोगों की एक संख्या के लिए निर्देशित उपचार18,19, 20 , 21 , 22 , 23. यह माना जाता था कि lysine acetylation केवल eukaryotes में होता है, लेकिन हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रोटीन acetylation भी बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, chemotaxis सहित, एसिड प्रतिरोध, सक्रियण, और स्थिरीकरण pathogenicity आइलैंड्स और अन्य डाह संबंधित प्रोटीन्स24,25,26,27,28,29.
एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया विधि जैव रासायनिक lysine acetylation विशेषताएं साइट का उपयोग कर रहा है-निर्देश mutagenesis । Glutamine अपने समान आकार और ध्रुवीयता की वजह से acetyllysine की नकल के रूप में प्रयोग किया जाता है । Arginine एक गैर acetylated lysine नकल के रूप में उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह शारीरिक स्थितियों के तहत अपने सकारात्मक आरोप को बरकरार रखता है, लेकिन acetylated नहीं हो सकता । हालांकि, दोनों की नकल असली isosteres नहीं है और हमेशा की उंमीद परिणाम30उपज नहीं है । सबसे कठोर दृष्टिकोण विशिष्ट lysine अवशेषों पर homogeneously acetylated प्रोटीन उत्पन्न करना है, जो प्रकृति7,11में lysine acetylation के कम stoichiometry के कारण अधिकांश शास्त्रीय विधियों के लिए कठिन या असंभव है । इस चुनौती आनुवंशिक कोड विस्तार की रणनीति है, जो एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase संस्करण Methanosarcinaceae प्रजातियों से tRNA के साथ Pylacetyllysine प्रभारी को रोजगार से सुलझाया गया है, मेजबान का उपयोग mRNA में UAG stop codon को दबाने के लिए शोधों मशीनरी, और लक्ष्य प्रोटीन की डिज़ाइन की गई स्थिति में acetyllysine का निगमन31का निर्देशन करता है । हाल ही में, हमने एक बेहतर EF-Tu-बाइंडिंग tRNA३२ और अपग्रेडेड acetyllysyl-tRNA synthetase३३के साथ इस सिस्टम को ऑप्टिमाइज़ किया है । इसके अलावा, हम malate डिहाइड्रोजनेज३४ और tyrosyl-tRNA synthetase३५के acetylation अध्ययन में इस बढ़ाया निगमन प्रणाली लागू किया है । इस के साथ साथ, हम malate डिहाइड्रोजनेज (MDH), जो हम बड़े पैमाने पर एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में अध्ययन किया है का उपयोग करके जैव रासायनिक पहचान के लिए आणविक क्लोनिंग से शुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।
गैर विहित अमीनो एसिड के आनुवंशिक शामिल (ncaas) एक सौंपा codon के दमन पर आधारित है, ज्यादातर एंबर बंद codon UAG३६,३७,३८,३९, ncAA द्वारा आरोप लगाया tRNA जिसमें संगत anticodon । के रूप…
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को NIH (AI119813), Arkansas विश्वविद्यालय की और से पुरस्कार Arkansas को विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |