Genetiske kode ekspansion fungerer som et effektivt redskab til at studere en bred vifte af biologiske processer, herunder protein acetylation. Her viser vi en letkøbt protokol til at udnytte denne teknik til at generere administrationsprocedurerne acetyleret proteiner på bestemte steder i Escherichia coli celler.
Posttranslationelle modifikationer, der finder sted på specifikke positioner af proteiner har vist sig at spille en vigtig rolle i en række forskellige cellulære processer. Blandt dem er Vendbar lysin acetylation en af de mest udbredte distribueret i alle områder af livet. Selv om talrige massespektrometri-baseret acetylome undersøgelser har været udført, har yderligere karakterisering af disse formodede acetylation mål været begrænset. En mulig årsag er, at det er vanskeligt at generere rent acetyleret proteiner på ønskede positioner ved de fleste klassiske biokemiske metoder. For at overvinde denne udfordring, er den genetiske kode ekspansion teknik blevet anvendt til at bruge par en manipuleret pyrrolysyl-tRNA syntetase variant, og dens beslægtet tRNA fra Methanosarcinaceae arter, til direkte cotranslational indarbejdelse af acetyllysine på det specifikke websted i protein af interesse. Efter første anvendelse i studiet af Histon acetylation, har denne tilgang lettet acetylation studier på en række proteiner. I dette arbejde viste vi en letkøbt protokol for at producere site-specifically acetyleret proteiner ved hjælp af model bakterien Escherichia coli som vært. Malat-dehydrogenase blev brugt som en demonstration eksempel i dette arbejde.
Posttranslationelle modifikationer (PTMs) af proteiner opstår efter oversættelsesprocessen og opstå fra kovalente tilsætning af funktionelle grupper til aminosyrerester, spiller vigtige roller i næsten alle de biologiske processer, herunder gen transskription, stressrespons, Celledifferentiering og metabolisme1,2,3. Til dato, omkring 400 markante er PTMs blevet identificeret4. Indviklet i genomet og proteomet forstærkes i stor udstrækning af protein PTMs, da de regulere protein aktivitet og lokalisering, og påvirke samspillet med andre molekyler som proteiner, nukleinsyrer, lipider og cofaktorer5.
Protein acetylation har været på forkant med PTMs undersøgelser i de sidste to årtier6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylation blev først opdaget i histonerne mere end 50 år siden13,14, har været godt undersøgt, og er kendt for at eksistere i mere end 80 transkriptionsfaktorer, lovgivere og forskellige proteiner15, 16,17. Undersøgelser på protein acetylation har ikke kun givet os en dybere forståelse af sin reguleringsmekanismer, men også guidet behandlinger for en række sygdomme forårsaget af dysfunktionelle acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. man mente at lysin acetylation kun sker i eukaryoter, men nylige undersøgelser har vist, at protein acetylation også spiller vigtige roller i bakteriel fysiologi, herunder chemotaxis, syre modstand, aktivering og stabilisering af sygdomsfremkaldende evne øer og andre virulens relaterede proteiner24,25,26,27,28,29.
En almindeligt anvendt metode til biokemisk karakterisere lysin acetylation bruger site-directed mutagenese. Glutamin er brugt som en efterligner af acetyllysine på grund af dens lignende størrelse og polaritet. Arginin er udnyttet som en ikke-acetyleret lysin efterligner, da den bevarer sin positive ladning fysiologiske betingelser, men kan ikke være acetyleret. Men begge efterligner er ikke rigtig isosteres og altid give ikke de forventede resultater30. Den mest stringent tilgang er at generere administrationsprocedurerne acetyleret proteiner på specifikke lysin rester, som er vanskeligt eller umuligt for mest klassiske metoder på grund af den lave støkiometrisk af lysin acetylation i naturen7,11. Denne udfordring har været bragt i orden af den genetiske kode ekspansionsstrategi, som beskæftiger en manipuleret pyrrolysyl-tRNA syntetase variant fra Methanosarcinaceae arter at oplade tRNAPyl med acetyllysine, udnytter værten Translationel maskiner til at undertrykke UAG stop codon i mRNA, og dirigerer indarbejdelse af acetyllysine i positionen designet af target protein31. For nylig har vi optimeret dette system med en forbedret EF-Tu-bindende tRNA32 og en opgraderet acetyllysyl-tRNA syntetase33. Derudover har vi anvendt denne forbedrede vedtægter system i acetylation undersøgelser af malat dehydrogenase34 og tyrosyl-tRNA syntetase35. Heri, vise vi protokol til at generere rent acetyleret proteiner fra de molekylære kloning til biokemiske identifikation ved hjælp af malat-dehydrogenase (MDH), som vi har grundigt undersøgt som en demonstrativ eksempel.
Den genetiske indarbejdelse af noncanonical aminosyrer (ncAAs) er baseret på undertrykkelse af en tildelt codon, for det meste rav stop codon UAG36,37,38,39, af den ncAA-opkrævet tRNA indeholdende den tilsvarende anticodon. Som det er kendt, UAG-codon er anerkendt af release faktor-1 (RF1) i bakterier, og det kan også være undertrykt af nær beslægtet tRNAer fra værter opkrævet af canoni…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH (AI119813), opstart fra University of Arkansas, og prisen fra Arkansas Biosciences Institute.
Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |