Vasculogenesis의 운동 분석 역학 Vasculogenesis 및 신생에서 생체 외에서 의 단정

1입니다. 준비 문화 내 피 식민지 형성 세포 (ECFCs)참고: 이러한 실험에 사용 된 태아 ECFC 샘플 인간 탯 줄 혈액에서 고립 되었고는 인디애나 대학의과 대학에 앞에서 설명한6Angio BioCore (ABC)에 의해 경작. 일상적인 품질 관리 형질 확인 앞에서 설명한19,,2021으로 내 피 항 원 표현에 ABC에서 실시 됐다. 실험에 사용 된 샘플 최소한 passaged 했다 (2-3 회). 모든 조직 문화 작업 조직 문화 후드에서 수행 되었다. 모든 시 약, 조직 문화 접시 등 솔루션, 메 마른 했다. 2 일 전에 실험, 100mm, 0.05 mg/mL 1 형 콜라겐의 6 mL와 조직 문화 접시 라운드 코트 고 37 ° C에서 밤새 품 어.참고: 1 형 콜라겐 20 nM 아세트산 0.05 mg/mL의 농도 작업에 포함 된 이중 증 류 물에 희석입니다. 실험 전날 trypsinize 그리고 1.1.1에 유형 1 콜라겐 코팅 판에 ECFCs replate. (참고 미만 1.1 참조). ECFCs, trypsinize 도금된 셀에서 미디어를 발음 하 고 7 mL의 PBS로 세척. PBS, 발음 그리고 0.5 %trypsin 2-3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분에 대 한 셀을 품 어 트립 신와 부 화 직후의 EGM2 피펫으로 아래로 모든 부착 세포를 꺼내 려 3 mL를 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 모든 샘플 원심 상쾌한 발음 그리고 다시 EGM2의 1-2 mL에 셀 알 약을 중단. 세포 현 탁 액을 철저 하 게 혼합 하 고 계산을 위한 작은 약 수 (20-40 μ)을 제거 합니다. Aliquot 셀으로 등분 trypan blue를 추가 하 고는 hemocytometer에 10 µ L 플라스틱. hemocytometer의 기본 4 사분면에는 셀의 수를 계산 합니다.참고: 모든 샘플 수에 대 한 hemocytometer의 양쪽 모두를 사용 하 여 정확도를 향상. 워시 콜라겐 코팅 조직 문화 접시, 1.1.1, PBS의 7 mL로 두 번 단계에서 준비 했다. 발음 두 번째 PBS 워시 (EGM2) 내 피 성장 매체 2의 10 mL를 추가 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 플레이트를 보충 하는 미디어 문화. 1.1.7 단계에서 얻은 셀 수를 사용 하 여 접시 4 x 105 셀에 필요한 세포 현 탁 액의 양을 계산 합니다. 플레이트 4 x 105 ECFCs 조직 문화 접시에 단계 1.1.8에서 준비 하 고 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 밤새 품 어. 실험 전에 저장 공급 4에 °C 하룻밤 3 “x 2” 금속 플레이트, 슬라이드 (후드에서 오픈까지 패키지로 유지), 살 균 20 microliter (μ) 팁, 그리고 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix)의 상자를 저장 합니다.참고: 매트릭스; 장기 저장용-80 ° C 보관 하룻밤 또는 사용 하기 전에 몇 시간 동안 항상 4 ° C에서 그것을 녹여. 컴퓨터의 하드 드라이브에 이미지에 대 한 충분 한 공간 여부를 확인 합니다.참고:이 프로토콜에서 설명 하는 구성을 사용 하 고, 약 60 기가바이트 (GB)의 공간이 실험 (4 g B/잘) 당 필요 했다. 그러나, 공간 견적 하드웨어 구성에 기초 하 고 각 시스템에 대 한 결정을 해야 합니다. 2. 프로토콜 1: 실험 설정: 슬라이드 준비 수집 및 공급을 준비 실험의 하루 얼음, 드라이 아이스의 작은 용기가 위, 및 20 μ 피 펫의 버킷을 포함 하 여 슬라이드에 세포를 도금에 대 한 공급을 수집 합니다. 모든 항목 70% 에탄올 스프레이, 종이 타 올, 건조 한 닦 고 항목 무 균 조직 문화 후드 합니다. 4 ° C에 저장 된 모든 용품을 수집 (단계 1.2 참조) 금속판, 팁, 슬라이드, 그리고 매트릭스의 상자를 포함 하 여. 70% 에탄올 스프레이 팁의 상자와 드라이 아이스의 컨테이너에 상자를 배치.참고: 제거 경우에 사용 하 고 항상 계속 얼음에 매트릭스 준비 4 ℃ 냉장고에서 매트릭스. 70% 에탄올과 금속판을 스프레이 하 고 얼음 양동이에 얼음에 포함. 슬라이드를 포함 하는 패키지를 열고 슬라이드 그것을 차가운 유지 하는 금속 격판덮개에 장소. 슬라이드에 부하 매트릭스 10 μ를 피펫으로 설정 하 고 피펫으로 차가운 팁 상자에서 끝을 제거. 가 위 팁의 끝에서 약 1cm를 잘라.참고: 컷 행렬에서 거품을 줄이기 위해 팁에 수직입니다. 피 펫 팁의 내부에 집착 하는 매트릭스에 대 한 계정에 10 μ 보다 약간 더 큰 볼륨을 설정할 수 있습니다. 천천히 피 펫 팁으로 매트릭스를 그립니다. 바로 피 펫 팁을 우물의 중앙에 놓습니다. 부드럽게 피 펫 팁 우물의 바닥을 터치 하 고 천천히 매트릭스 밖으로 밀어.참고: 마 안 피 펫, 이상이 하면 거품 형태로. 만약 거품 형태의 작은 팁을 사용 하 여 즉시 팝업. 슬라이드 15 개인 우물을 포함합니다. 각 잘에 대해 이전 단계를 반복 합니다. 각 잘 새로운 피 펫 팁을 사용 하 여 일관성을 유지 하 고 매트릭스 팁 내부 응고를 감소. 일단 슬라이드 매트릭스를 포함 하는 모든 웰 스와 함께 로드 됩니다, 슬라이드에 있는 모든 방법을 뚜껑을 밀어 하 고 매트릭스 굳은 때까지 30-60 분 동안 37 ° C에서 품 어.참고:는 매트릭스를 밖으로 건조 하지 마십시오. 매트릭스 건조의 위험을 줄이기 위해 인큐베이터에서 슬라이드 근처 50 mL 원뿔 튜브의 캡에 PBS의 작은 볼륨 (2-3 mL)를 추가 합니다. 3. 프로토콜 2: 도금 행렬에 ECFCs 조직 배양 배지에서 점착 ECFCs를 제거 하 고 서 스 펜 션에 수집 조직 문화는 ECFCs를 포함 하는 접시 도금 전날 (참조 섹션 1.1.9)를 가져옵니다. EGM2 미디어를 발음 하 고 점착 ECFCs 7 mL의 PBS로 한 번 씻어. PBS를 발음, 트립 신의 2-3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분에 대 한 부착 셀을 품 어 부 화 직후의 EGM2 피펫으로 아래로 모든 부착 세포를 꺼내 려 3 mL 추가 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 반복 단계 3.1.1-3.1.3 나머지 3 ECFC 샘플에 대 한 모든 4 개의 셀 샘플에에서 수집 됩니다. 믹스 마스터 준비 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 모든 샘플 원심 상쾌한 발음 그리고 다시 EGM2의 1-2 mL에 셀 알 약을 중단. 세포 현 탁 액을 철저 하 게 혼합 하 고 계산을 위한 작은 약 수 (20-40 μ)을 제거 합니다. Aliquot 셀으로 등분 trypan blue를 추가 하 고 10 μ는 hemocytometer에 플라스틱. hemocytometer의 기본 4 사분면에는 셀의 수를 계산 합니다.참고: 모든 샘플 수에 대 한 hemocytometer의 양쪽 모두를 사용 하 여 정확도를 향상. 위에서 계산 셀을 사용 하 여, 1.4×104 셀에 포함 된 각 셀 샘플의 볼륨을 계산 합니다. 모든 셀 정지를 철저 하 게 혼합 하 고 각 실험 조건에 대 한 마스터 믹스를 준비 하는 신선한 튜브로 104 셀 x aliquot 1.4. 각 마스터 믹스의 마지막 볼륨은 175 μ EGM2 미디어를 추가 합니다. 슬라이드에서 개별 우물으로 마스터 믹스의 부드럽게 pipetting 및 aliquot 50 μ에 의해 각 마스터 믹스 믹스.참고: 모든 샘플 마스터 믹스 3.5 우물 3 웰 스에 대 한 충분 한 볼륨을 보장 하기 위해 계산 된 3 중에 도금 됩니다. 슬라이드를 품 어 이미징을 위한 현미경 챔버로 이동할 수 있습니다 때까지 37 ° C에서 슬라이드를 품 어.참고: 도금 및 이미징 사이의 시간 vasculogenesis의 초기 단계 동안 데이터 손실을 제한 하 가능한 간단한 이어야 한다. 4. 3 프로토콜: 현미경 설치 및 이미지 수집 참고: 우리의 연구에 대 한 프로토콜 2 및 3 실시 했다 동시에 별도 개인에 의해. 프로토콜 2와 3은 동일한 개인에 의해 완료 해야 합니다, 만약 프로토콜 3 단계 4.1 및 4.2 아래 위의 프로토콜 2를 시작 하기 전에 완료 되어야 한다. 현미경 및 컴퓨터 실험을 시작 하기 전에 약 1 ~ 2 시간 설정 하 고 37 ° C에 단계 가기 인큐베이터를 예 열, 5% CO2 를 설정 습도 85%로 설정. 비어 있는 경우 부 화기의 습도 공기 통을 채우십시오. 두 오픈 위치 중 하나에 빈 연 발된 슬라이드를 배치 하 고 증류수를 채워. 사용 가능한 경우 챔버 온도 제어, 피드백 온도계를 보호 합니다.참고: 의견 온도계를 사용할 수 있는 경우 사용이 “인큐베이터 온도” 챔버 equilibrated 있다 확인 하. 39-42 ° C 아래에서 슬라이드를 열 및 응축을 최소화로 설정 하는 보조 송풍기를 켭니다. 실험적인 슬라이드를 추가할 수 있습니다 때까지 빈으로 두 번째 슬라이드를 추가 합니다. 이 슬라이드는 설치 하는 동안 개별 웰 스에 대 한 이미지 수집 설정의 구성에 대 한 위치 자리 표시자 역할을 합니다. 이미징 실험 기간 동안 상태를 모방 하는 두 번째 슬라이드에 우물 주변 저수지에 물을 추가 합니다. 물 우물을 둘러싼 현미경 설치 및 예 열 하는 동안 습도의 평가 수 있습니다.참고: 단계 가기 인큐베이터 및 보조 송풍기의 전 평형은 안정적인 자란 환경 유지 중요 합니다. 대부분의 라이브 셀 챔버 컨트롤러2및 시스템의 준비 상태를 평가 하기 위해 습도 온도, CO의 실시간 피드백을 제공 합니다. 계속, 이전 슬라이드에 습도의 축적과 4.1.5에 가득 저수지의 과도 한 건조를 확인 합니다. 습도 경우 과도 한 건조 또는 응축 챔버에 조정 될 필요가 있습니다. 습도 증가, 잎사귀 증류수와 접촉을 추가 합니다. 응축을 감소, 감소 습도 설정 4.1.1에 조정 하거나 응축 저온의 표시 될 수, 챔버 온도 설정 및 보조 송풍기의 위치를 확인 합니다. 재래식 동안 기본 이미지 수집 설정을 구성 합니다.참고: 이미지 수집 단계, 셔터, 및 카메라 제어 소프트웨어를 통해 구성 됩니다. 다차원 설치 도구는 소프트웨어를 구성 하는 가장 쉬운 방법은. 또한, 소프트웨어 자동 루틴을 실험의 기간에 초점 제어를 해야 합니다. 소프트웨어를 사용 하 여 각 음에 대 한 여러 단계 위치를 설정 하려면. 이 프로토콜에 대 한 우물의 센터를 선택 합니다. 각 단계 위치에서 전체 잘은 몇 군데 이미지 수집을 구성 합니다. 예를 들어 10-20% 이미지 겹치기와 카메라와 최종 확대에 따라 약 5 x 5 필드는 tilescan를 사용 합니다. 모든 15 분 영상에 대 한 시간 경과 구성 합니다.참고:이 프로토콜에서 설명 하는 구성을 사용 하는 슬라이드의 모든 15 웰 스는 15 분 간격 내 몇 군데. 실험적인 슬라이드 로드 인큐베이터 챔버의 평형, 다음 실험 슬라이드 빈 슬라이드를 교체 합니다.참고: 안정적인 온도, CO2, 그리고 적어도 20 분 동안 습도 equilibrated 챔버를 있을 것 이다. 실험적인 슬라이드 준비가 되 면, 그 단계를 수행 해야 신속 하 게 “배달 시간”을 최소화 하기 위해 도금 및 현미경에 의해 점령 초기 시간 포인트 사이 필수적입니다. 또한, 이미징 실험 사이 비교를 촉진 하기 위하여이 시간 일관 되어야 합니다. 이 실험에서 프로토콜 3 4.3 섹션에에서 설명 된 모든 단계를 완료 하려면 약 30 분 필요 합니다. 슬라이드 뚜껑을 제거 하 고 슬라이드에 우물 주변 저수지에 물을 추가.참고: 뚜껑 이미징 실험 하는 동안 제거 됩니다. 최종 이미지 수집 설정 구성 CFI 계획 Fluor DL 10 X 목표 위치에 배치 하 고 콘덴서에 Ph1 단계 반지를 선택 합니다. 초점에서 첫 번째 잘 쾰러 조명에 대 한 diascopic 빛 경로 조정 하 고 객관적인 위상 마스크와 콘덴서에 위상 링의 맞춤을 선택 하 여 위상 광학을 구성 합니다. 노출 시간을 구성 하 고는 일반적으로 500 밀리초 미만 단계 대조에 대 한 램프 강도 조정 합니다. 4.2.1에서 각 단계 위치 설정 하 고 필요한 경우 우물의 중심을 선택 하 고, 그것을 조정 하는 것을 확인. 각 단계 위치에서 셀 우물에서 도금과 무대 위치 z 위치 이미징 소프트웨어에서 사용 설정에 초점. 현미경에 대 한 자동 초점 메커니즘을 테스트 합니다. 자동 초점 하드웨어 기반 하는 경우에, 그것에 및 올바르게 모든 무대 위치에 대 한 위치를 확인 합니다.참고: 견본 및 무대는 실험 기간 동안 수직으로 드리프트 수 있습니다, 그것은 중요 한 소프트웨어 각 단계 위치 및 시간-과정 동안 안정적인 이미지를 보장 하기 위해 모든 시간-포인트 자동 초점 확인. 만약에 가능 하다 면, 이전 시간 지점에서 결정 하는 자동 초점 위치 이후의 자동 루틴에 대 한 시작 지점으로 사용 될 해야 합니다. 이러한 방법으로, 온가 드리프트 수 있습니다 조정할 수 쉽게. 감소 또는 현미경 방에 빛을 소화 하 고 이미징 실험을 시작 합니다. 5. 프로토콜 4: 이미지 Vasculogenesis (KAV)의 처리 및 운동 분석 각 잘 이미지 스택으로 개별 시간 포인트에서 이미지를 저장참고: 이미지 캡처에 대 한 대부분의 소프트웨어는 다중 페이지 tiff (스택) 시계열의 내보낼 수 있습니다. KAV는 여러 시간 포인트를 포함할 수 있는 데이터 집합에서 작동 하도록 설계 되었습니다. 따라서, 분석 주어진된 무대 위치에 대 한 전체 이미지 스택에 발생합니다. 필요한 경우 이미지 프로세싱 소프트웨어는 이미지 스택을 재구성을 각 시간 지점에서 단일 이미지를 가져올 수 있습니다. 컴퓨터에서 소프트웨어를 처리 하는 이미지를 엽니다 이미지 프로세싱 소프트웨어에 KAV를 추가 소프트웨어 창 하단의 회색 바에 KAV 파일을 폴더에서 끕니다. 소프트웨어 목록에 추가 하려면 ‘저장’을 클릭 합니다. 분석 이미지 스택을 엽니다 클릭 하십시오 ‘파일’ 다음 ‘열기’ 이미지 프로세싱 소프트웨어, 또는 단계 5.3.1 에서처럼 회색 표시줄에 드래그 이미지 파일 드롭다운 메뉴를 통해. ‘이미지’, ‘유형’, ‘8 비트’를 클릭 하 여 8 비트 이미지를 변환 합니다. 관심 (ROI) 영역 만들기 도구 모음에서 ‘분석’을 클릭 하 여 투자 수익 관리자를 엽니다. 뒤에 ‘ 투자 수익 관리자 ‘에서 ‘ 도구’를 선택 합니다. 원 또는 사각형 선택 도구 도구 모음에서 클릭 하 여 이미지에 원하는 선택 영역 그리기 새로운 투자 수익을 만듭니다. 그 모양을 저장 ROI 관리자 창에서 ‘ 추가’를 클릭 합니다.참고: 이전에 만든된 투자 수익 열 수 있습니다 저장 ROIs (압축된 폴더)을 드래그 하 여 관리자에서 ‘드래그 앤 드롭’ 바에. 투자 수익 라벨 이미지에 그것을 볼 수 아 관리자에 나열을 클릭 합니다.참고: 경우 ROI는 이미지에 표시 되지 않습니다, 두 번째 투자 수익 (어떤 크기/모양) 만들고 관리자에 추가 합니다. 일단 둘 다 두 사이 이리저리 클릭 ROIs는 목록에 표시 하 고 원하는 투자 수익 이미지에 표시 됩니다. 필요한 경우 투자 수익을 맞춥니다. 투자 수익 되 면 원하는 위치에 이미지에 장소, 메뉴에가 고 ‘수정’을 클릭 후 ‘ 분명 밖에 서 ‘. 이 스택의 모든 이미지에 대 한 투자 수익 (비 직사각형 모양에 대 한 유용한) 외부 이미지 데이터를 삭제 합니다.참고: 당신은 클릭할 수 있다 또한 ‘이미지’와 ‘자르기’ rectangularly 모양의 ROI를 사용 하는 경우. KAV 소프트웨어 실행 메뉴 표시줄에서 ‘ 플러그인 ‘을 클릭 합니다. ‘ 네트워크 분석 플러그인. 이 플러그인에서 설정을 변경 하는 옵션 창이 열립니다. 드롭다운 화살표를 사용 하 여 임계 처리 방법을 변경. 일단 적절 한 설정을 모두 선택 소프트웨어 처리를 시작 하려면 ‘ 확인’을 클릭 합니다.참고: 적절 한 설정은 식별 하 고 분별 세포와 위상 대비 이미지에 배경에서 네트워크 소프트웨어의 채택해 지표는 KAV에 의해 생성 된 골격과 마스크 변환 시각화를 통해 결정 됩니다. KAV에서 생성 된 데이터를 저장 일단 플러그인 분석 완료, 두 개의 창이 숫자 값과 퓨즈 이미지 뼈대와 마스크 변환 묘사의 스택 데이터 테이블을 포함 하 여 화면에 팝업 것입니다. 데이터 테이블의 상단 왼쪽된 모서리에 이동 하 여 숫자 값을 저장 하 고 클릭 하면 ‘수정’ 다음 ‘복사’ 또는 ‘컷’ excel 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다. 융합된 뼈대와 마스크 이미지를 클릭 하십시오. 파일 클릭 하 여 ‘,’ ‘ 다른 이름으로 저장 ‘ ‘티파니.’ 융합된 해골/마스크 이미지 스택 태그 이미지 파일 형식 (TIFF) 파일로 저장 자른된 단계 대조를 저장 스택 (ROI를 사용 하 여 만든) ‘파일 을’ ‘ 다른 이름으로 저장 ‘ ‘티파니.’를 클릭 하 여 이미지 투자 수익 관리자 창에서 클릭 하 고 이미지를 자르려면 사용 ROI를 선택. ‘더’ 뒤에 나중에 사용에 대 한 투자 수익을 저장 하려면 ‘저장’을 클릭 합니다.참고: 사용 같은 ROI 분석에 걸쳐 일관성을 유지 도움이 됩니다.