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Biologia do Desenvolvimento

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/57044
, , ,
1Department of Cellular and Integrative Physiology,Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research,Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy,Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine,Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics,Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology,Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center,Indiana University School of Medicine

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für Zeitraffer-Aufnahmen und Analyse der Vaskulogenese Verwendung von in-vitro- phase Kontrast Mikroskopie gekoppelt mit der open-Source-Software, kinetische Analyse der Vaskulogenese. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um das Vasculogenic Potential von zahlreichen Zelltypen oder experimentellen Bedingungen, die arterielle Verschlusskrankheit modellieren quantitativ zu bewerten.

Abstract

Vaskulogenese ist ein komplexer Prozess, der durch den Stamm- und Vorläuferzellen Endothelzellen de Novo Schiff Ausbildung unterziehen. Quantitative Bewertung der Vaskulogenese ist eine zentrale Auslesen der endothelialen Vorläuferzellen Zellfunktionalität geworden, und daher wurden mehrere Versuche unternommen, in Vitro und in Vivo Vaskulogenese Modelle zu verbessern. Allerdings sind Standardmethoden, mit statischen Messungen nicht zu viele Aspekte dieses hoch dynamischen Prozesses erfassen eingeschränkt. Daher war das Ziel der Entwicklung dieser neuartigen Protokoll zur Bewertung der Kinetics von in-vitro- Vaskulogenese um quantitate Preise der Netzwerkbildung und Stabilisierung sowie Einblick in mögliche Mechanismen, die vaskuläre Dysfunktion. Anwendung dieses Protokolls wird demonstriert mit fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFCs), mütterlichen Diabetes Mellitus. Fetale ECFCs wurden abgeleitet aus Nabelschnurblut nach der Geburt, kultiviert und vergoldet in Folien mit Basalmembran Matrix, wo sie Vaskulogenese unterzogen. Bilder der gesamten Folie Brunnen wurden aufgenommen mit Zeitraffer Phasenkontrastmikroskopie über 15 Stunden. Bilder wurden zur Ableitung von quantitativen Daten mithilfe einer Analysesoftware namens kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) analysiert. KAV verwendet Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung Netzwerkkomponenten aus Stapeln von Multi-Zeit Punkt Kontrast Phasenbilder abzuleiten zehn Parameter (9 gemessen, 1 berechnet) des Netzwerk einschließlich der Struktur zu analysieren: Netzwerke, Netzbereiche, geschlossen Knoten, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, Netzstrukturen und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis. Anwendung dieses Protokolls identifiziert verändert Preise der Vaskulogenese in ECFCs von Schwangerschaften, die durch Diabetes Mellitus kompliziert erhalten. Diese Technik hat jedoch große Auswirkungen würde den Rahmen sprengen, hier berichtet. Umsetzung dieses Ansatzes fördert die mechanistische Bewertung und Verbesserung der funktionellen Auslesen Vaskulogenese und anderen biologisch wichtigen Verzweigung Prozesse in zahlreichen Zelltypen oder Krankheitszustände.

Introduction

Die Fähigkeit der endothelialen Vorläuferzellen, Vaskulogenese, oder de Novo Schiff Bildung zu unterziehen ist kritisch embryonalen Gefäßsystem zu etablieren, während der Entwicklung1. Darüber hinaus ist weitere Schiff Bildung und Reifung der bereits vorhandenen Schiffe, die als Angiogenese bezeichnet wird, auch ein Schlüsselprozess in Entwicklung und postnatale Leben, Durchblutung und Homöostase im gesamten Körper2zu erhalten. Jedes Organ im Körper ist das Gefäßsystem für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und für die Beseitigung von Abfall3abhängig. Vaskuläre Homöostase ist nicht gepflegt, so dass Blutgefäß-Bildung und Reparatur entweder unzureichend oder im Übermaß sind, können Gefäßerkrankungen4führen. Daher werden vaskulären Bildung und Anpassung häufig untersucht, wie sie unerlässlich bei der Aufrechterhaltung der Organgesundheit sind und sind in die Entwicklung der zahlreichen pathologische Staaten involviert.

Wegen einem besseren Verständnis der Beteiligung des Gefäßsystems in Entwicklung, sowie bei Manifestation der Krankheit und dem Fortschreiten entwickelten Assays Modell Vaskulogenese und Angiogenese in Vitro und in Vivo5 ,6,7. Modellieren Schiff Bildung umfasst das Plattieren vaskulärer Zellen, wie Endothelzellen in Basalmembran-Matrix, die Zelle Organisation und Bildung von Schiff Netze8,9,10fördert. In der Regel folgende Übernachtung Inkubation, Bilder der Zelle, die Netze zu einem einzigen Zeitpunkt, führt eine kleine Anzahl von Bildern zur Analyse11,12,13erfasst werden. Daher wurden für einzelne Zeitpunkt Bewertungen10,14analytische Ansätze weitgehend entwickelt und optimiert. Jedoch statische Analysen sind einfach nicht ausreichend zur Erfassung des dynamischen Prozesses der Gefäß-Bildung und begrenzten Einblick in mögliche Mechanismen beteiligt. Obwohl immer häufiger bildgebende wahrscheinlich die notwendigen Daten zur Bildung Kinetik zu erkennen geben würde, wäre Anwendung der zuvor entwickelten Analytics zu einem Multi-Zeit Punkt imaging Ansatz ineffizient und arbeitsintensiv intensive14. Darüber hinaus macht trotz Entwicklung der kommerziell verfügbaren Analysen, eine Gebühr zahlen pro Bild diese Option für kinetische Untersuchungen, in denen Tausende von Bildern erzeugt15sind, kostspielig. Deshalb müssen in das Feld für einen schlanken und effizienten Ansatz zu erfassen und zu quantifizieren, Vaskulogenese in Vitro, einschließlich der Fähigkeit, große Bildsätze erzeugte Zeitraffer live Zelle Mikroskopie zu analysieren.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein neues Konzept entwickelt, mit dem Ziel der Erweiterung einzigen Zeitpunkt Bildgebung ermöglichen dynamische Beurteilung der Vaskulogenese mit Bilder alle 15 min16erworben. Durch die Erfassung von mehreren Zeitpunkten über mehrere Stunden, stellt dieser Ansatz eine detailliertere Darstellung des Prozesses der Vaskulogenese, sowie einen Einblick in mögliche Mechanismen, die einen Beitrag zur Bildung und Erhaltung des Schiffes Netzwerke. Dieser Ansatz beinhaltet neben der Verbesserung der Häufigkeit und Qualität der Bildaufnahme, neuartige Software in Form von einem Open-Source-Plug-in17. Die Software, bezeichnet als kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV), ist eine optimierte Anwendung, die Bildverarbeitung und Analyse speziell für großes Bild-Sets aus mehreren Zeit-Punkt Akquisitionen generiert enthält. KAV analysiert Phase kontrastreiche Bilder durch Bild Segmentierung gefolgt von Skelettierung18. Zehn Parameter der Netzwerkstruktur durch KAV quantifiziert sind unter anderem: Zweige, geschlossene Netze, Knoten, Netzbereiche, Netzwerkstrukturen, dreifach verzweigten Knoten, Quad verzweigte Knoten, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge und Ortsverbandes Knoten-Verhältnis (siehe schematisch in Abbildung 1)16. Anwendung des KAV-Konzepts enthält einen neuartigen, berechnete Phänotyp von in-vitro- Vaskulogenese, als der Zweig Knoten-Verhältnis bezeichnet. Unsere aktuelle Arbeiten gezeigt, dass dieses Verhältnis bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität ist und andere zelluläre Prozesse, Netzwerkbildung, z. B. Motilität16zugeordnet werden.

Obwohl fetalen Endothelzellen koloniebildenden Zellen (ECFC) Vaskulogenese in diesen Studien beurteilt wurde, kann dieses Bild-Erfassung und Analyse-Ansatz ohne weiteres angewendet werden, um alle Zelltypen zu bewerten, die Vaskulogenese oder Angiogenese zu unterziehen. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verwendet werden, um veränderte Gefäßfunktion, die aus einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie gestational Diabetes Mellitus zu identifizieren, wie in diesen Studien gezeigt. Darüber hinaus könnte diese Methode bewerten, Netzwerkbildung und Verzweigungen, die wichtig sind für andere biologisch relevante Prozesse angepasst werden. So ist die potenziellen Auswirkungen der Anwendung dieser neuartigen Ansatzes auf einzigartige biologische Systeme noch nicht ermittelt werden.

Protocol

1. Vorbereitungen Kultur endotheliale koloniebildenden Zellen (ECFCs)Hinweis: In diesen Experimenten verwendete fetalen ECFC Proben wurden von menschlichen Nabelschnurblut isoliert und kultiviert die Angio BioCore (ABC) an der Indiana University School of Medicine als zuvor beschrieben6. Routinemäßigen Qualitätskontrolle Phänotypisierung erfolgte innerhalb der ABC, Ausdruck der endothelialen Antigene als zuvor beschriebenen19,20,21zu bestätigen. In den Experimenten verwendete Proben waren minimal passagiert (2-3 Mal). Alle Gewebekultur Arbeiten wurden in einer Gewebekultur Haube durchgeführt. Alle Reagenzien, einschließlich Gewebekultur-Platten und -Lösungen, waren steril. Zwei Tage vor dem Experiment, 100 mm Runde Gewebekultur Platten mit 6 mL 0,05 mg/mL-Typ-1-Kollagen zu beschichten und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.Hinweis: Typ-1-Kollagen wird in bidestilliertem Wasser mit 20 nM Essigsäure eine arbeiten-Konzentration von 0,05 mg/mL verdünnt. Am Tag vor dem Experiment, trypsinize und replate ECFCs auf den Typ 1 Kollagen beschichtete Platten in 1.1.1. (Siehe Hinweis unter 1.1). Um ECFCs trypsinize, aspirieren Sie Medien aus vergoldeten Zellen und mit 7 mL PBS waschen. Aspirieren Sie PBS, dann fügen Sie 2-3 mL 0,5 % Trypsin und inkubieren Zellen für 2-5 min bei 37 ° c Fügen Sie unmittelbar nach der Inkubation mit Trypsin, 3 mL EGM2 und Pipettieren rauf und runter, alle adhärente Zellen verdrängen. Übertragen Sie Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie überstand und neu auszusetzen Sie Zelle Pellets in 1-2 mL EGM2. Die Zellsuspension gründlich mischen und eine kleine aliquoten (20-40 μl) für die Zählung zu entfernen. Die Zelle aliquoten Gleichteile Trypan Blau hinzu und pipette 10 µL auf ein Hemocytometer. Die Anzahl der Zellen in den vier primären Quadranten der Hemocytometer.Hinweis: Verwenden Sie beide Seiten des Hemocytometer für alle Probe zählt zur Erhöhung der Genauigkeit. Waschen Sie die Kollagen-beschichtete Gewebe-Kultur-Platten, die im Schritt 1.1.1, zweimal mit 7 mL PBS vorbereitet wurden. Nach dem Absaugen der zweiten PBS waschen, fügen Sie 10 mL endotheliale Wachstumsmedium 2 (EGM2) Kultur Medien mit 10 % fötalen Rinderserum an den Platten ergänzt. Berechnen Sie mit Hilfe der Zellzahlen in Schritt 1.1.7 erhaltenen, das Volumen der Zellsuspension auf Platte 4 x 105 Zellen erforderlich. Platte 4 x 105 ECFCs auf den Tellern der Gewebekultur in Schritt 1.1.8 vorbereitet und über Nacht bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubieren. Vor dem Experiment speichern liefert bei 4 °C über Nacht Speichern einer 3 “x 2” Metallplatte, Rutsche (im Paket bis in die Kapuze öffnen behalten), eine Schachtel mit sterilen 20 Mikroliter (μl) Tipps und Basalmembran Matrix (Matrix).Hinweis: Die Matrix ist bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung gehalten; Tauen Sie es immer bei 4 ° C, über Nacht oder für mehrere Stunden vor dem Gebrauch. Verfügbarkeit von ausreichend Platz für die Bilder auf den Computer-Festplatten zu bestätigen.Hinweis: Wenn Sie die Konfiguration dieses Protokolls, waren etwa 60 Gigabyte (GB) Speicherplatz pro Experiment (4 GB/Na) erforderlich. Jedoch Raum Schätzungen basieren auf Hardware-Konfiguration und müssen für jedes System bestimmt werden. 2. Protokoll 1: Versuchsaufbau: Vorbereitung der Folie Sammeln und bereiten Lieferungen Am Tag des Experiments, Vorräte für galvanischen Zellen auf der Folie, einschließlich einen Eimer mit Eis, einen kleinen Behälter mit Trockeneis, Schere und einer 20 μl Pipette. Sprühen Sie alle Elemente mit 70 % Ethanol, wischen Sie mit Papiertüchern trocken, und platzieren Sie Elemente in einer sterilen Gewebekultur-Haube. Alle Vorräte bei 4 ° C gelagert (siehe Schritt 1.2) einschließlich der Metallplatte, Schachtel mit Tipps, Rutsche und Matrix. Sprühen Sie das Kontrollkästchen Tipps mit 70 % Ethanol und legen Sie das Feld in den Behälter von Trockeneis.Hinweis: Entfernen Sie Matrix aus dem Kühlschrank 4 ° C nur, wenn Sie bereit sind zu verwenden und halten Sie die Matrix auf Eis. Sprühen Sie die Metallplatte mit 70 % Ethanol und Binde sie in das Eis in den Eiskübel. Öffnen Sie das Paket mit der Folie und legen Sie die Folie auf der Metallplatte um es kalt zu halten. Last-Matrix auf der Folie Legen Sie die Pipette auf 10 μL und entfernen Sie die Spitze von kalten Tipp-Box mit der Pipette. Ca. 1 cm vom Ende die Spitze mit der Schere ausschneiden.Hinweis: Schneiden Sie senkrecht auf der Spitze, Luftblasen in der Matrix zu reduzieren. Die Pipette kann auf ein Volumen geringfügig größer als 10 μL für Matrix festhalten an der Innenseite der Spitze Konto eingestellt werden. Ziehen Sie langsam die Matrix in die Pipettenspitze. Sofort setzen Sie die Pipettenspitze auf die Mitte des Brunnens. Sanft berühren die Pipettenspitze an der Unterseite des Brunnens und langsam schieben der Matrix heraus.Hinweis: Do führt nicht über Pipette, wird als das Bläschen zu bilden. Wenn sich eine Blase bildet, fügen Sie es sofort mit einer kleinen Spitze. Die Folie enthält 15 individuelle Vertiefungen. Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für jede Vertiefung. Verwenden Sie eine neue Pipettenspitze für jedes gut, um Konsistenz und reduzieren Matrix verfestigen der Geheimtipp. Sobald die Folie mit allen Wells mit Matrix geladen ist, schieben Sie den Deckel auf der Folie und Inkubation bei 37 ° C für 30-60 min bis die Matrix erstarrt.Hinweis: Lassen Sie nicht die Matrix austrocknen. Fügen Sie ein kleines Volumen (2-3 mL) von PBS in der Kappe einer 50 mL konische Röhre in der Nähe der Folie in den Inkubator zur Verringerung des Risikos von Matrix zu trocknen. 3. Protokoll 2: Galvanik ECFCs auf Matrix Entfernen Sie Anhänger ECFCs aus Gewebekultur Platten und sammeln Sie in der Schwebe Beziehen Sie Gewebekultur, die Platten mit den ECFCs am Vortag (siehe Abschnitt 1.1.9) überzogen. Aspirieren Sie EGM2 Medien und waschen Sie Anhänger ECFCs einmal mit 7 mL PBS. Aspirieren Sie PBS, fügen Sie 2-3 mL Trypsin und inkubieren adhärente Zellen für 2-5 min bei 37 ° c Fügen Sie unmittelbar nach der Inkubation, 3 mL EGM2 und Pipettieren rauf und runter, alle adhärente Zellen verdrängen. Übertragen Sie Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr. Wiederholen Sie Schritte 3.1.1-3.1.3 für die restlichen drei ECFC Proben, bis alle vier Zellproben in der Schwebe gesammelt werden. Bereiten Sie master-mixes Zentrifugieren Sie alle Proben bei 500 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie überstand und neu auszusetzen Sie Zelle Pellets in 1-2 mL EGM2. Die Zellsuspension gründlich mischen und eine kleine aliquoten (20-40 μl) für die Zählung zu entfernen. Die Zelle aliquoten Gleichteile Trypan Blau hinzu und pipette 10 μL auf eine Hemocytometer. Die Anzahl der Zellen in den vier primären Quadranten der Hemocytometer.Hinweis: Verwenden Sie beide Seiten des Hemocytometer für alle Probe zählt zur Erhöhung der Genauigkeit. Mit Hilfe der Zelle von oben zählt, berechnen Sie das Volumen jeder einzelnen Zelle-Probe, die 1.4×104 Zellen enthält. Alle Zellsuspensionen durchmischen und aliquoten 1.4 x 104 Zellen in ein frisches Rohr, einen master-Mix für jede Versuchsbedingung vorzubereiten. Fügen Sie EGM2 Medien hinzu, so dass der letzte Band der einzelnen master-Mix 175 μL. Mischen Sie jeder master-Mix durch sanft pipettieren und aliquoten 50 μL des master-Mix in einzelnen Vertiefungen auf der Folie.Hinweis: alle Proben sind in dreifacher Ausfertigung, mit master-Mixes für 3,5 Brunnen, ausreichendes Volumen für 3 Brunnen ordnungsgemäß berechnet beschichtet. Inkubieren Sie die Folie Inkubieren Sie die Folie bei 37 ° C, bis es für die Bildgebung in der Mikroskop Kammer bewegt werden kann.Hinweis: Die Zeit zwischen Beschichtung und Bildgebung sollte so kurz wie möglich, Verlust von Daten während der frühen Stadien der Vaskulogenese zu begrenzen. 4. Protokoll 3: Mikroskop Setup und Bildaufnahme Hinweis: Für unsere Studien wurden Protokolle 2 und 3 gleichzeitig durch einzelne Individuen durchgeführt. Wenn Protokolle 2 und 3 von der gleichen Person abgeschlossen werden muss, sollte vor dem Einleiten von Protokoll Nr. 2 genannten Protokoll 3 Schritte 4.1 und 4.2 unten abgeschlossen sein. Schalten Sie das Mikroskop und computer Schalten Sie ca. ein bis zwei Stunden vor Beginn des Experiments und den Bühne Top Inkubator auf 37 ° C vorheizen, CO2 auf 5 % festgelegt und stellen die Luftfeuchtigkeit 85 %. Füllen Sie den Inkubator Luftfeuchtigkeit, wenn leer. Legen Sie eine leere gekammerten Folie in einer der beiden stellen, und mit destilliertem Wasser auffüllen. Sichern Sie das Feedback-Thermometer für die Kontrolle der Temperatur der Kammer, falls vorhanden.Hinweis: Wenn das Feedback-Thermometer zur Verfügung steht, verwenden diese “Inkubator”Temperatur zu überprüfen, ob die Kammer equilibriert hat. Schalten Sie eine sekundäre Gebläse, 39-42 ° C erhitzen die Folien von unten und Kondensation minimieren soll. Fügen Sie eine zweite Folie als Leerzeichen, bis die experimentellen Folie hinzugefügt werden kann. Diese Folie dient als Standort Platzhalter für die Konfiguration der Erwerb Bildeinstellungen für individuelle Vertiefungen während des Setups. Fügen Sie Wasser in den Behälter rund um den Brunnen auf der zweiten Folie, die Bedingungen während der imaging Experiment zu imitieren. Das Wasser rund um die Brunnen erlaubt eine Beurteilung der Feuchtigkeit beim Mikroskop einrichten und Vorwärmen.Hinweis: Pre-Gleichgewichtherstellung der Bühne-Top Inkubator und sekundäre Gebläse ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer stabilen Kultivierung Umgebung. Die meisten live Zelle Kammer Controller geben Echtzeit-Feedback von Temperatur, CO2und Feuchtigkeit an die Bereitschaft des Systems zu beurteilen. Überprüfen Sie vor dem fortfahren, die Ansammlung von Feuchtigkeit auf der Folie und übermäßiges Trocknen des Stausees in 4.1.5 gefüllt. Luftfeuchtigkeit müssen möglicherweise angepasst werden, wenn es übermäßige Trocknung oder Kondenswasser in der Kammer. Um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen, fügen Sie wischt mit destilliertem Wasser benetzt. Um Kondensation zu verringern, verringern Sie die Feuchtigkeitseinstellung in 4.1.1 angepasst oder prüfen Sie Kondensation eine niedrige Temperatur hindeuten könnte, die Kammer-Temperatur-Einstellungen und die Positionierung des sekundären Gebläses. Konfigurieren Sie grundlegende Bildeinstellungen Erwerb während Gleichgewichtherstellung.Hinweis: Bildaufnahme wird durch Software konfiguriert, die die Bühne, die Verschlusszeit und die Kamera steuert. Eine mehrdimensionale Setup-Tool ist die einfachste Möglichkeit, die Software zu konfigurieren. Darüber hinaus benötigen die Software Autofokus-Routinen, Fokus-Kontrolle über die Dauer des Experiments zu gewährleisten. Verwenden Sie die Software auf mehreren Bühne für jedes gut eingestellt. Dieses Protokoll wählen Sie in der Mitte der Brunnen. Konfigurieren Sie die Bildaufnahme so, dass an jeder Tischposition, das gesamte gut abgebildet wird. Z. B. eine Tilescan mit 10-20 % Bildüberlappung und ca. 5 x 5 Feldern, je nach Kamera und letzte Vergrößerung. Konfigurieren Sie die Zeitspanne für imaging-alle 15 min.Hinweis: Wenn Sie die Konfiguration, die in diesem Protokoll beschrieben, sind alle 15 Brunnen der Folie innerhalb eines 15-Minuten-Intervall abgebildet. Laden der experimentellen Folie Ersetzen Sie nach Gleichgewichtherstellung der Inkubator Kammer die leere Folie mit der experimentellen Folie.Hinweis: eine äquilibriert Kammer haben stabile Temperatur, CO2und Feuchtigkeit für mindestens 20 Minuten. Sobald die experimentellen Folie fertig ist, ist es unerlässlich, dass Schritte zur Minimierung der “Totzeit” zwischen Beschichtung und der erste Zeitpunkt durch das Mikroskop erfasst schnell abgeschlossen sind. Darüber hinaus sollten zur Erleichterung der Vergleich zwischen bildgebenden Experimenten diesmal übereinstimmen. In diesen Experimenten erforderlich, alle Schritte in Protokoll 3 Abschnitt 4.3 ca. 30 min in Anspruch. Folie Deckel und füllen Sie Wasser in das Reservoir rund um den Brunnen auf der Folie.Hinweis: Deckel wird für die Dauer des bildgebenden Experiments entfernt. Endbild Erwerb Einstellungen konfigurieren Die CFI planen Fluor DL 10 X-Objektiv in Position bringen und wählen Sie den Ph1 Phase Ring auf den Kondensator. Passen Sie mit dem ersten Brunnen im Fokus Durchlicht-Strahlengang für Köhler Beleuchtung an und konfigurieren Sie Phase Optik durch Ausrichtung der Phase Ring in den Kondensator mit der objektiven Phase Maske aktivieren. Konfigurieren Sie die Belichtungszeit und die Intensität der Lampe für Phasenkontrast, die in der Regel weniger als 500 ms. Durchlaufen Sie jede Position Bühnenbild in 4.2.1 und bestätigen Sie, dass das Zentrum des Brunnens ausgewählt ist, und passen sie, falls erforderlich. Konzentrieren Sie an jeder Tischposition sich auf die Zellen plattiert in den Brunnen und die Tischposition Z Position für die Bildgebung in der Software verwendet. Testen Sie den Autofokusmechanismus für das Mikroskop. Wenn der Autofokus Hardware-basierte ist, stellen Sie sicher es eingeschaltet ist und richtig für alle Positionen der Bühne positioniert.Hinweis: während der Probe und das Stadium während des Experiments vertikal treiben können, ist es wichtig, dass die Software den Autofokus an jeder Tischposition und jeden Zeitpunkt zuverlässig Bildgebung im Laufe der Zeit-darauf überprüfen. Wenn möglich, sollte eine Autofokus-Position in der früheren Zeitpunkt bestimmt als Ausgangspunkt für die spätere Autofokus-Routine verwendet werden. Auf diese Weise kann laufend Drift für leicht angepasst werden. Reduzieren Sie oder erlöschen Sie die Lichter in den Mikroskop-Raum und starten Sie das Image Experiment zu. 5. Protokoll Nr. 4: Image Processing und kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) Speichern von Bildern aus einzelnen Zeitpunkten als ein Bildstapel für jedes gutHinweis: die meiste Software für Bilderfassung kann mehrseitige TIFF-Dateien (Stacks) von Zeitreihen exportieren. KAV soll auf Datasets arbeiten, die mehrere Zeitpunkte beinhalten kann. So tritt Analyse auf dem gesamten Bildstapel auf eine Stufe Stelle. Bei Bedarf kann die Bildverarbeitungssoftware Einzelbilder aus jeden Zeitpunkt einem Bildstapel zu rekonstruieren importieren. Öffnen Sie die Bildverarbeitungs-Software auf dem computer Die Bildverarbeitungssoftware fügen Sie KAV hinzu Ziehen Sie die KAV-Datei aus einem Ordner in der grauen Leiste am unteren Fensterrand Software. Klicken Sie auf “Speichern”, um die Software zu der Liste hinzufügen. Öffnen Sie den Bildstapel zu analysierenden Klicken Sie auf “Datei” dann “Offen” über das Drop-Down-Menü in der Bildbearbeitung Software, oder ziehen Sie die Image-Datei in der grauen Leiste wie in Schritt 5.3.1. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit durch Klicken auf “Bild”, “Typ”, “8-Bit”. Erstellen einer Region of Interest (ROI) Öffnen Sie den ROI-Manager durch Klicken auf “Analyze” in der Symbolleiste. Wählen Sie dann “Werkzeuge” gefolgt von “ROI-Manager”. Erstellen Sie einen neuen ROI durch Klicken auf den Kreis oder ein Rechteck Auswahl-Werkzeuge in der Werkzeugleiste und zeichnen das Bild der gewünschten Auswahlbereich. Klicken Sie auf “Hinzufügen” in das ROI-Manager-Fenster um die Form zu speichern.Hinweis: Ein zuvor erstellte ROI kann geöffnet werden durch ziehen, ROIs (ZIP-Ordner) gespeichert in die ‘Drag and Drop’ Bar im Manager zu öffnen. Klicken Sie auf das ROI-Label im ROI-Manager auf Bild anzeigen aufgelistet.Hinweis: Wenn der ROI nicht auf dem Bild angezeigt werden, erstellen Sie einen zweite ROI (jede Größe/Form) und fügen Sie es an den Manager. Sobald beide ROIs in der Liste erscheinen, klicken Sie auf hin und her zwischen den beiden und der gewünschten ROI auf dem Bild erscheint. Richten Sie den ROI, wenn nötig. Sobald der ROI auf dem Bild an der gewünschten Stelle steht, gehen Sie zum Menü und klicken Sie auf “dann”Draußen klar”Bearbeiten”. Dadurch werden die Bilddaten außerhalb des ROI (nützlich für nicht-rechteckige Formen) für jedes Bild im Stapel gelöscht.Hinweis: Sie können auch klicken Sie auf “Bild” und “Crop” verwendest du einen rechtwinklig geformten ROI. Führen Sie die KAV-software Klicken Sie in der Menüleiste auf “Plug-ins”. Wählen Sie das “Netzwerk zu analysieren” Plug-in. Es öffnet sich ein Fenster mit Optionen, um die Einstellungen im Plugin ändern. Ändern Sie die Schwellwerte Methode mithilfe der Drop-down-Pfeil. Wenn alle entsprechenden Einstellungen ausgewählt haben, klicken Sie auf “OK”, um Software-Verarbeitung zu initiieren.Hinweis: Geeignete Einstellungen richten sich durch Visualisierung von Skelett und Maske Überstellungen von KAV, erzeugt die sind bezeichnend für die Steigerung der Software zu identifizieren und zu erkennen, Zellen und Netzwerke aus Hintergrund in der Phase kontrastreiches Bild. Der KAV-generierte Daten speichern Sobald das Plug-in die Analyse abgeschlossen ist, öffnet sich zwei Fenster auf dem Bildschirm, einschließlich einer Datentabelle mit numerischen Werten und einen Stapel von fusionierten Bilder darstellen Skelett und Maske Formatvarianten. Speichern Sie die numerischen Werte durch die Navigation zu der oberen linken Ecke der Datentabelle und klicken auf ‘bearbeiten’, dann ‘Kopieren’ oder ‘Ausschneiden’, um Werte in einem Excel-Arbeitsblatt einfügen. Klicken Sie auf das geschmolzene Skelett und Maske Bild. Speichern Sie die verschmolzenen Skelett/Maske Bildstapel als Tagged Image Datei Format (TIFF) Datei, indem Sie auf ‘Datei’, ‘Speichern unter’ “TIFF”. Speichern Sie die zugeschnittenen Phasenkontrast Bild Stack (erstellt mit ROI) indem Sie auf “Datei” “Speichern unter” “TIFF”. Klicken Sie auf das Fenster ROI-Manager und wählen Sie den ROI verwendet, um die Bilder zuschneiden. Klicken Sie auf “Mehr” gefolgt von “Speichern”, den ROI für eine spätere Verwendung zu speichern.Hinweis: Mit der gleichen ROI hilft Konsistenz über Analysen zu erhalten.

Representative Results

KAV erzeugt visuelle Darstellungen der NetzwerkstrukturDer Kontrast zwischen der ECFCs und der Matrix Hintergrund in die Phasenbilder Kontrast ermöglicht KAV, zellspezifische Strukturen zu identifizieren. ECFC Netzwerke von KAV identifiziert vertreten sind bildhaft als Skelett und Maske Darstellungen zur Veranschaulichung von Strukturen, die von der Software zur Quantifizierung (Abb. 2A) verwendet. Wichtig ist, ermöglicht qualitative Bewertung der Skelett und Maske Formatvarianten schnelle Identifizierung von KAV Empfindlichkeit und Genauigkeit, die bei der Bestimmung der optimalen Schwellenwerteinstellungen und Interpretation Analyse-Ergebnisse nützlich sein können. Wenn die Qualität der Bilder Phase Kontrast hoch ist und ausreichender Kontrast erreicht, identifiziert KAV genau ECFC Netzwerke wie durch Ähnlichkeit zwischen der Phase kontrastreiches Bild und die KAV-generierte Skelett und Maske Wiedergaben (Abbildung 2 A und Video 1). Alternativ, wenn Kontrast Phasenbilder keinen hohen Kontrast und/oder Artefakte von imaging wie Gitterlinien auftreten, Netzwerk Erkennungsgenauigkeit wird reduziert und Ergebnisse werden nicht eindeutig ist (Abbildung 2B). Bildung von Luftblasen innerhalb der Zelle Medien kann darüber hinaus auch Erkennungsgenauigkeit (Abbildung 2) verdecken. Jedoch können Probleme mit der Bildqualität durch Auswahl von verschiedenen Schnittstellenüberwachung Methoden in der KAV-Software enthalten oft überwunden werden. Beispielsweise wurde die Phase Kontrast Bild in Abbildung 2B mit identisches Bild Bearbeitung Einstellungen außer der Schnittstellenüberwachung Methode analysiert. Von Skelett und Maske Formatvarianten ist es offensichtlich, dass die Otsu Schnittstellenüberwachung eine genauere Erkennung der ECFC Netze Phase Kontrast Bild (Abbildung 2B) geführt. Daher ist die Bildqualität entscheidend für genaue und aussagekräftige Ergebnisse in diesem Test. Allerdings ermöglichen unterschiedliche Schwellwerte Methoden in der KAV-Benutzeroberfläche Anpassung der Bildanalyse anhand der Qualität der Bilder. Time-Lapse Mikroskopie ermittelt qualitative und quantitative Unterschiede in ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner gestational Diabetes Mellitus ExpositionVor kurzem wurde der KAV analytische Ansatz angewandt, um fetale ECFC Funktion nach Exposition gegenüber mütterlichen Typ 2 Diabetes Mellitus (T2DM) in Utero16festzusetzen. KAV, veränderte Kinetik der Vaskulogenese wurden identifiziert in fetalen ECFCs T2DM ausgesetzt. Allerdings beeinträchtigt die Exposition, die während der gesamten Schwangerschaft, gestational Diabetes Mellitus (GDM) oder die Entwicklung von Glucose-Intoleranz häufig im dritten Trimester der Schwangerschaft auftritt, neben T2DM auch ECFC Funktion13. Daher wurde KAV angewendet, um festzustellen, ob GDM-exponierten ECFCs auch veränderte Kinetik der ECFC Netzwerkbildung anzeigen. Phase 1 (0-5 h) und Phase 2 (5 + h) wurden anhand Zeit verfallen Mikroskopie gepaart mit KAV Analyse (Abbildung 3). Repräsentative Phasenbilder Kontrast zu Beginn der Bildaufnahme (0,50 h) erworben und in den zeitlichen Verlauf (5,00 bis 10,00 Uhr) zeigen ECFC Netzwerkbildung in der vier Proben von einem experimentellen Tag (Abbildung 3 und Video 1 ). Trotz entsprechenden Zelle laden, wie in der Phase kontrastreiche Bilder 0,50 Stunden beobachtet sind qualitative Unterschiede in der Netzwerkstruktur offensichtlich zu den 5,00 und 10,00-Stunden Zeitpunkten. ECFCs von der unkomplizierten Schwangerschaft (UC) bilden eine komplexe und komplizierte Netzwerk 5 Stunden nach dem Plattieren, ähnlich wie unsere bisher veröffentlichten Daten16. Im Gegensatz dazu probieren ECFCs von GDM 1 (GDM1) Form sehr wenige Strukturen vernetzen, die nicht miteinander verbunden sind. Allerdings spiegelt dieses Muster nicht in alle ECFC Proben aus GDM Schwangerschaften, bezeichnend für Heterogenität zwischen den Proben. GDM2 Proben und GDM3 anzeigen mehr Netzwerkbildung im Vergleich zu GDM1, obwohl die Muster der Konnektivität veränderten im Vergleich zu den UC-Probe erscheinen. Wichtig ist, misst KAV mehrere strukturelle Komponenten ECFC Netzwerke, offensichtliche und subtile Phänotypen zu identifizieren. Neben der Erzeugung von Skelett und Maske Wiedergaben der Netzwerkstruktur, quantitates KAV 10 Metriken Netzstruktur, einschließlich der Anzahl der individuelle Netzwerkstrukturen, Knoten, dreifach verzweigten Knoten, Knoten vierfach verzweigt, Zweige, total Astlänge, durchschnittliche Astlänge Knoten-Verhältnis, total geschlossen Filialnetze und Netzwerk-Bereich16. KAV kompiliert die Daten für jede Probe in einer einzelnen Tabelle mit Werten für alle Bilder von den zeitlichen Verlauf. Tabelle 1 enthält repräsentative Rohdaten aus einer bildgebenden Studie für eine ECFC Probe. Parameter der Netzwerkstruktur gemessen von KAV gliedern sich in Spalten, und die Daten für die aufeinander folgenden Bildern, die im Laufe der Zeit erworben sind in Zeilen unterteilt. Für Beispiel, in unseren Studien, Bild 1 30 min nach dem Überzug mit nachfolgenden Bildern erworben wurde, wird alle 15 min. Rohwerte erzeugte gesammelt, KAV kann dann grafisch dargestellt oder weiter analysiert mit Hilfe komplexer statistischer Ansätze16. Fünf Graphen zeigt Mittelwerte der Netzwerkstruktur aus drei separaten Experimente sind für eine unkomplizierte Einzelprobe (UC) und die drei GDM-Proben (Abbildung 4) dargestellt. Die UC-Probe in diesen Experimenten ähnlich zu zuvor analysiert UC Proben16. Zuvor wurde festgestellt, dass ECFC Vaskulogenese in Vitro Bi-phasisch, bestehend aus Phase 1 (0 – 5 h) und Phase 2 (5-10 h)16. Dieses Muster entspricht in aktuellen Studien, wie der Graph Darstellung geschlossenes Netzwerkdaten (Abbildung 4) belegt. Die UC-Probe gebildet eine größere Anzahl von geschlossenen Netzwerken im Vergleich zu allen drei der GDM Proben. Interessanterweise erscheinen drei der vier Proben zu einer ähnlichen Zeit, maximale Anzahl der geschlossenen Netzen, die zwischen 2,5 und 3 Stunden stattfindet. Allerdings war die GDM2 Probe langsamer maximale geschlossene Netze zu erreichen, die 5 Stunden Post-Beschichtung ist aufgetreten. Und trotz der GDM2 Probe weniger maximale Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe zu bilden, die Netzwerke, die es bildet wurden ebenso beibehalten, die UC-Probe im Laufe der Zeit. GDM1 und GDM3, die weniger Netzwerke im Vergleich zu den UC-Probe gebildet, stellte hingegen eine Verringerung Netzwerknummer im Laufe der Zeit. Insgesamt aus dem Diagramm Darstellung geschlossene Netzwerknummer, ist es offensichtlich, dass alle ECFC Proben eine Bi-phasisch Muster der Netzwerkbildung, angezeigt, aber die Bildung und die maximale Anzahl von Netzwerken erreicht über Proben variieren. Netzwerkbereich stellt den durchschnittlichen Bereich innerhalb der geschlossenen Netze durch die ECFCs gebildet. Deshalb, je größer die geschlossene Netzwerk Nummer, je kleiner der Netzbereiche. Dieses Muster spiegelt sich in den Netzwerk-Bereich Grafiken wo die UC-Probe, die eine größere Anzahl von geschlossene Netzwerke gebildet, kleinere Netzbereiche im Laufe der Zeit im Vergleich zu den drei GDM-Proben (Abbildung 4 hatte). GDM2, die maximale geschlossene Netze langsamer erreicht, stellte hohe Netzwerkbereich zunächst, jedoch stabilisiert das Gebiet über Zeit, und dies um 15 Uhr die UC-Probe am ähnlichsten war. Im Laufe der Zeit stieg die durchschnittliche Netzwerkbereich in allen Proben aufgrund Netzwerk de-Stabilisierung. Einige Beispiele, wie GDM1 und GDM3, stellte jedoch einen rascheren Anstieg der Netzwerkbereich, die verringerte Stabilität im Vergleich zu anderen Proben ausstellen einen allmählichen Anstieg wahrscheinlich ein Indikator ist. GDM-exponierten ECFCs weisen geringere NetzwerkstabilitätDas Verhältnis der Zweige zu Knoten ist eine neuartige Phänotyp von KAV berechnet und in unseren früheren Studien identifiziert, und dies ist bezeichnend für Netzwerk-Konnektivität16. In der aktuellen Studie wies die UC-Probe ein niedriges Verhältnis, das ein hohes Maß an Netzwerkkonnektivität zu vertreten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 4) gepflegt wurde. Dagegen hatte die drei Proben, GDM ein höheres Verhältnis von Zweigen, Knoten, vor allem in Phase 2 der Netzwerkbildung. Diese Beobachtung zeigt reduzierten Konnektivität und de-Stabilisierung von Netzwerkstrukturen. Insgesamt bildeten GDM1 weniger Knoten und Zweige, die im Vergleich zu den anderen Proben mit der Reduktion erhalten im Laufe des Experiments. GDM2 und GDM3 gebildet und eine größere Anzahl von Filialen im Vergleich zu den UC-Probe, vor allem zwischen 5-15 h. Die Anzahl der Knoten in der GDM2 und GDM3 Netzwerke erkannt wurden mehr Ähnlichkeit mit der Anzahl der Knoten in der UC-Probe, vor allem zwischen 10-15 Uhr. Eine größere Anzahl von Filialen, aber eine ähnliche Anzahl von Knoten, könnte die erhöhte AST Knoten-Verhältnis deutlich zu späteren Zeitpunkten in den GDM-Proben entfallen. Wichtig ist, können gleichzeitige Änderungen im Zweig und Knoten schwierig in getrennten Diagrammen zu interpretieren sein. Jedoch bietet die neue Niederlassung Knoten-Verhältnis eine Möglichkeit, bewerten, wie Änderungen, einschließlich schwer zu erkennen, in den einzelnen Diagrammen im Zweig und Knoten, geringfügige Änderungen in veränderten Netzwerkkonnektivität führen. Abbildung 1 : Schaltplan skizziert 10 Parameter quantifiziert durch kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV). KAV quantitates zehn verschiedene Parameter der Netzwerkstruktur. Alle Parameter sind farblich gekennzeichnet und beschrieben im Schaltplan numerisch (1-10). Die Parameter umfassen die Anzahl der Filialen (grün 1), geschlossen Netze (blau, 2) und Knoten (rot, 3), durchschnittlich Netzwerkbereich (Orange, 4), die Anzahl der Netzwerkstrukturen (schwarz, 5), dreifach verzweigten Knoten (gelb, 6) und Quad-verzweigte Knoten (lila, 7), sowie Total (9) und (10) Zweig Durchschnittslänge und das Verhältnis der Anzahl der Filialen an die Anzahl der Knoten (10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : Kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) quantitates Netzwerkstruktur. (A) Skelett und Maske Überstellungen von Netzwerkstrukturen von KAV mit Phase bieten kontrastreiche Bilder visuelle Darstellung von Netzwerkstrukturen identifiziert und quantifiziert durch KAV identifiziert. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) eine repräsentative Phase Kontrast Bild von ECFC Netzwerke-10 h Post-Beschichtung, die niedrigen Kontrast und Raster hat markiert aus einzelne Bildern zusammenfügen. Unterschiedliche Schwellwerte Methoden, z. B. Mittelwert oder Otsu, wählbar in den KAV-Plug-in, Quantifizierung Genauigkeit zu verbessern, wenn Kontrast Phasenbilder kontrastarmen haben oder Gitterlinien auftritt. Skelett und Maske Wiedergaben der Phase kontrastreiches Bild sind für mittlere und Otsu Schnittstellenüberwachung Methoden gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Intrauterine GDM Belichtung verändert ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Repräsentative Phase kontrastreiche Bilder in 5 h-Schritten, beginnend bei der Beschichtung (0,5 h), sind für die UC und drei GDM Proben gezeigt. Phase kontrastreiche Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv erfasst. Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : ECFCs, intrauterine GDM Ausstellung verändert Netzwerk Bildung Kinetik ausgesetzt. ECFCs wurden von einer unkomplizierten Schwangerschaft (UC, schwarz) und drei Schwangerschaften kompliziert durch gestational Diabetes Mellitus (GDM 1-3, rot) erhalten. Phase wurden Kontrast Aufnahmen in 15 min. Intervalle für 15 h. kinetische Analyse der Vaskulogenese (KAV) Software quantitated geschlossen Netze, Netzbereiche, Niederlassungen, Knoten und das Verhältnis der Zweige zu Knoten. Illustrierte Darstellung der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von drei separaten Experimenten für jede Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Video 1: Intrauterine GDM Belichtung verändert Kinetik der ECFC Netzwerkbildung. Bilder der ECFC Netzwerkbildung wurden in 15 Minuten Intervallen für 15 h von Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen. Phasenbilder Kontrast werden für die UC und drei GDM Proben über 15 h ab 0,5 h angezeigt. Die Maßstabsleiste stellt 500 µm. Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download) Bild Insgesamt Filialnetze Knoten Dreibettzimmer Viererzimmer Filialen Insgesamt Zweig Länge * AVG-Zweig Länge * Filiale Knoten-Verhältnis Geschlossene Netze Netzwerk-Bereich ** 1 382 290 278 11 943 47210 124 3.25 9 480214 2 284 345 337 8 940 50699 179 2,72 16 264469 3 205 376 366 9 910 55728 272 2.42 27 150621 4 162 422 407 15 947 59692 368 2.24 40 98713 5 132 454 441 12 967 61923 469 2.13 53 72951 6 122 435 419 14 907 62587 513 2.09 68 56948 7 88 429 411 17 852 63983 727 1.99 74 51429 8 68 451 437 13 874 63960 941 1,94 74 51780 9 93 437 417 18 905 60901 655 2.07 49 82919 10 126 511 487 24 1075 61981 492 2.1 37 116857 11 49 397 384 12 737 61823 1262 1.86 79 48805 12 81 376 364 10 751 56817 701 2 63 64431 13 98 509 482 26 1028 60799 620 2.02 44 98056 14 93 449 416 31 909 58282 627 2.02 45 94081 * gerundet zur nächsten Mikron ** gerundet zur nächsten Mikron ^ 2 Tabelle 1: Repräsentative Rohdaten aus einer Bildgebung zu studieren, für ein ECFC Beispiel.

Discussion

KAV ermöglicht Auswertung großer Datenmengen mit mehreren Zeitpunkten
Traditionell bestand Quantifizierung der Vaskulogenese in Vitro eine Single oder ein paar Mal Punktmessungen. Diese statische Methode ist schlicht ungenügend für die Erfassung und Quantifizierung einen dynamischen und komplexeren Prozess. Daher wurde diese neuartige Methode entwickelt, um effiziente Analysen des Netzwerk Bildung Kinetik Einblick in mögliche molekularen Mechanismen des dynamischen Prozesses der Vaskulogenese zu ermöglichen. Effizienz und Automatisierung sind wichtige Bestandteile bei der Entwicklung neuer Techniken zur Erzeugung und Analyse von großen Mengen an Bilddaten. KAV wurde entwickelt, speziell um großes Bild Stapel bestehend aus Hunderten von Bildern, die Zeit und Arbeitsaufwand biologisch sinnvolle Schlussfolgerungen aus Zeitraffer Datensätzen ableiten senken zu analysieren. Vor allem KAV führt Bildverarbeitung und Datengenerierung in einer Angelegenheit von Sekunden für kleine (weniger als 100 Bilder) image-Stacks und Minuten für größere (mehr als 100 Bilder) Bild-Stapel, beispiellose Effizienz führt. Darüber hinaus ermöglicht die Organisation der Daten in Tabellenkalkulationen von Zeit und gemessenen Parameter schnelle Erzeugung von grafische Darstellung und statistische Analyse.

Herausforderungen bei der erfolgreichen Anwendung dieses Ansatzes
Obwohl dieser Assay Verbesserungen zur Bildaufnahme und Analyse enthalten sind, können einige Herausforderungen erfolgreiche Umsetzung behindern. Die vier Haupthindernisse sind Luftfeuchtigkeit Stabilität, Timing Präzision von Beschichtung zur Bildaufnahme, Software und Hardwarezuverlässigkeit und Verwaltung großer Datenmengen erzeugt für jedes Experiment. Stabil live Cell Imaging über mehrere Stunden kann schwierig sein. Insbesondere ist angemessen und konsequent Befeuchtung für die Bildgebung Kammern erforderlich. In diesem Assay, eignen sich für Matrix-basierte Angiogenese-Assays parallelisieren Angiogenese Folien eingesetzt. Ihre geringe Volumen, ca. 50 µL macht Verdampfung und Kondensation wichtige Überlegungen zur erweiterten Kulturbedingungen. Um dieses experimentelle Problem zu bekämpfen, ist es notwendig, einen Inkubator zu verwenden, der Feuchtigkeit reguliert. Allerdings kann es auch sein erforderlich, um diese Verordnung zu erweitern, wenn übermäßiges Trocknen der bildgebenden Kammer im Laufe der Zeit auftritt. Wir fanden, dass die einfachste Methode zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit ist Wasserfläche in der Kammer zu erhöhen. Um dieses Ziel zu erreichen, schlägt unser Protokoll die folgenden drei Wasserquellen: eine zweite Kammern Folie gefüllt mit Wasser, die auch bei die Brutkasten Temperatur gemessen wird, Wasser in der Gegend um den Brunnen auf den Folien und benetzte Filterpapier oder wischt. Umgekehrt tritt Kondensation, wenn die Lufttemperatur im Raum unten auf die Folie kühlt und die Feuchtigkeit im Inneren der Kammer auf den Folien und den Brunnen kondensiert. Diese Komplikation kann führen zu einer Verwässerung der Zelle Medien und ein Linseneffekt, die mit dem Phasenkontrast stört. In diesen Studien wurde durch Anwendung der erwärmten Luft (39-42 ° C) auf die Unterseite der Folie Kondenswasser minimiert.

Ein entscheidendes Kriterium für eine Zeitraffer-Studie ist die Konsistenz zwischen Experiment Einleitung und Bildgebung. Das Timing der Bildgebung beim Starten ist entscheidend für Interpretation der nachgeschalteten Ereignisse. Um die Präzision Timing des Assays zu gewährleisten, sollte die Zeit zwischen den ersten Beschichtungs- und der erste Zeitpunkt der abgebildeten streng kontrolliert werden. In der Praxis dieses “Totzeit” minimiert werden, aber noch wichtiger ist, es muss konsequent, Experimente an verschiedenen Tagen verglichen werden können. Zum Beispiel erwarten wir in diesem Protokoll eine Totzeit von etwa 30 Minuten. Dies kann durch die Nähe der experimentellen Vorbereitung und imaging-Einrichtungen erleichtert werden.

Was mag wie banalen Details auf den ersten Blick für Software, Hardware-Stabilität und Datenmanagement wichtig sind. Software und zugehörige Hardware-Treiber, Netzwerk-Umgebung und automatisierte Software-updates alle beeinflussen die Stabilität der Software. Es lohnt sich dieses Testprotokoll in ein “Dry Run” zu identifizieren Sie Engpässe und mögliche Ursachen für Probleme in der Bildaufnahme; zum Beispiel für unzuverlässig live Zelle Setup, Bühne, Auslöser und Kamera Zuverlässigkeit und institutionellen Informationspolitik Technologie auf automatisierte Betriebssystem und Software-Updates überprüfen.

Datenmanagement ist ein ständiges Anliegen jedes imaging Experiment, das Hunderte oder Tausende von Bildern erzeugt. Zum Glück sucht kommerzieller Software oft verfügbaren Platz vor dem Start ein imaging Experiment. Dieser Test umfasst aber auch Post-Capture-Bildverarbeitung und Analyse, die die Festplatte Platz Last hinzufügen und stören mit imaging-Experimente, wenn der verfügbare Speicherplatz begrenzt ist. Darüber hinaus können die Sicherheit und Stabilität des Computers, auch mit Hardware-Lösungen wie z. B. eine redundante Festplattenarray identisch garantiert werden. Somit ist eine Daten-Management-Strategie darauf Platz auf den Festplatten für laufende Experimente und eine robuste Fernbedienung Archivierung, zum Beispiel mit einer institutionellen Archivierung Ressource erforderlich.

Strategien zur Maximierung der Bildqualität
Obwohl die Fähigkeit des KAV, genau ECFCs aus dem Matrix Hintergrund erkennen robust ist, richtet sich die Empfindlichkeit des Tests auf die Bildqualität. Hat das Bild geringen Kontrast, wird die Software beispielsweise Zelle Netzwerke mit geringerer Genauigkeit (Abbildung 2B) erkennen. Die Qualität der Phasenkontrast wird von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Einstellungen des Mikroskops zur Bildaufnahme, beeinflusst von der Matrix und die Zelle Aussetzung Medien während der Assay-Erstellung und Pflege von medialen Ebenen innerhalb der Brunnen laden in der gesamten Bildgebung. Zur Optimierung der Phasenkontrast für diese Assays wurden kleinere Anpassungen an Ring Phasenanpassung im Mikroskop Kontrast zu verbessern. Darüber hinaus wurde Probenvorbereitung rigoros getestet, um gleich und konsequente Medien laden zu gewährleisten. Wenn der Betrag der Matrix und/oder Druckmedien in die Vertiefungen unterhalb oder oberhalb des optimalen Bereichs ist, kann ein Meniskus führt zu veränderten Phasenkontrast bilden. Schließlich ist es aufgrund des geringen Volumens der Flüssigkeit in den Vertiefungen, entscheidend für Medien Niveau zu halten, durch die Minimierung der Verdampfung und Kondensation, wie oben erwähnt. Insgesamt ist Assay Optimierung kritischer Kontrast Bilder in hoher Qualität für die Analyse zu generieren.

Neben der Phase Kontrast Qualität können andere Faktoren auch Assay-Ergebnisse einschließlich der Medien Verunreinigung, Mängel in der Matrix, und Partikel oder Schmutz in die Matrix oder Medien auswirken. Kontamination ist eine Gefährdung des Assays, denn es geht um live Cell Imaging über mehrere Stunden in einer Mikroskopie-Kammer. Um das Risiko einer Kontamination zu reduzieren, sind die Matrix und Zelle Aufhebungen auf der Folie in eine sterile Haube geladen. Darüber hinaus ist jede Probe in der Regel doppelt oder dreifach für ein Experiment zur Minimierung des Risikos von Datenverlust aufgrund von unvorhergesehenen Problemen wie Schmutz oder Partikel Störfaktoren die Analyse plattiert.

Probe Heterogenität Laufwerke müssen für erhöhte Assay Empfindlichkeit
Heterogenität beobachtet und berichtet in früheren Studien von ECFCs, GDM13ausgesetzt. Ein hohes Maß an Heterogenität in der Zelle Funktion in diesen Proben beobachtet wird spekuliert, um darauf zurückzuführen sein, mehrere Faktoren, die Schwere der mütterlichen Erkrankung, Dauer der Krankheit und Management-Stil verwendet, um den Blutzuckerspiegel zu regulieren. Wichtig ist, fängt dieser analytischen Ansatz der dynamischen Bereich ECFC Vaskulogenese, so dass es möglich ist, phänotypische Unterschiede aufgrund der funktionalen Heterogenität in Proben von GDM Schwangerschaften zu identifizieren. Insgesamt kann die Verwendung von primären Patientenproben, wie Sie in diesen Studien, größere Variabilität im Vergleich zu einer Zelllinie einführen. Als stärker auf translationale Studien mit mehreren primären tierischen oder menschlichen Proben mit funktionellen Variabilität gelegt wird, unbedingt Assay Sensitivität für die Erkennung und Ableitung von biologisch sinnvolle Messungen und Schlussfolgerungen. Aus diesem Grund generiert Entwicklung von Ansätzen wie KAV die Quantität und Qualität der Daten verbessert werden durch in-vitro- Vaskulogenese und Angiogenese Assays damit robuster Beobachtungen und Schlussfolgerungen. Außerdem erleichtert diese Daten zukünftige Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die zu veränderten ECFC Vaskulogenese nach intrauteriner GDM-Exposition beitragen.

Zukünftige Anwendungen dieses Ansatzes
Obwohl diese Methode angewendet wurde, um fetale ECFC Vaskulogenese in Vitro in diesen Studien zu bewerten, sind die Einsatzmöglichkeiten dieses Ansatzes zahlreich. Diese Technik kann leicht implementiert werden, um jede Zellpopulation zu studieren, die in den Prozessen der Vaskulogenese oder Angiogenese beteiligt ist. Speziell, es kann verwendet werden, um einzelne Zellpopulationen zu studieren, wie in dieser Studie zeigte, aber es könnte auch zu Kokultur Systeme angewendet werden. In Zukunft wäre es vorteilhaft, diesen Ansatz über die zweidimensionale in Vitro Assay dreidimensionale (3D) Modelle beurteilen zu erweitern. Obwohl die aktuelle Version von KAV für Quantifizierung 3D Bilddaten nicht ausreichen würden, wäre ein ähnlich gestaltete Zeitraffer, multiparametrischen analytische Ansatz speziell für 3D oder in Vivo Modelle informieren, wenn in zwei Dimensionen Beobachtungen in Vitro sind Vertreter der Zellfunktion in eine mehr biologisch relevante Einstellung.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Munder, Matthew Repass und Emily Sims (Angio BioCore an der Indiana University Simon Cancer Center) für ausgezeichnete technische Unterstützung bei der Ableitung ECFC Proben. Die Autoren erkennen auch DRS. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder und Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) wissenschaftlichen Diskussion sowie Janice Wände (Indiana University School of Medicine) für administrative Unterstützung. Alle Bildgebung wurde an der Indiana-Zentrum für biologische Mikroskopie, Indiana University School of Medicine durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 und U10-HD063094) und der Riley Children Foundation unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Publikation mit teilweiser Unterstützung vom National Heart, Lung und Blut-Institut von der National Institutes of Health unter Award # T32 HL007910 möglich.

Materials

100mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15ml conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10x
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis
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Referências

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. . ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
  15. . WimTube Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012)
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).

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Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).
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