血管血管和血管生成的动力学分析体外

1. 准备工作 培养内皮细胞集落胞 (ECFCs)注意: 这些实验中使用的胎儿 ECFC 样本是从人类脐带血中分离出来的, 并由印第安纳大学医学院的血管造影 BioCore (ABC) 进行培养, 如前所述6。常规质量控制分在 ABC 内进行, 以确认内皮抗原的表达, 如先前所描述的19,20,21。实验中使用的样品传代最小 (2-3 次)。所有组织培养工作都是在组织培养罩中进行的。所有的试剂, 包括组织培养皿和溶液, 都是无菌的。 在实验前两天, 将100毫米圆形组织培养皿涂上6毫升0.05 毫克/毫升1型胶原蛋白, 在37° c 过夜孵育。注: 1 型胶原被稀释在含有 20 nM 乙酸的双蒸馏水中, 其工作浓度为0.05 毫克/毫升。 在实验前的前一天, 处理和 replate ECFCs 对1型胶原涂层板进行1.1.1。(见附注 1.1)。 处理 ECFCs, 从镀膜细胞中吸取培养基, 用7毫升 PBS 冲洗。吸 PBS, 然后加入2-3 毫升0.5% 胰蛋白酶和孵育细胞2-5 分钟在37° c。 紧接孵化后与胰蛋白酶, 添加3毫升的 EGM2 和吸管向上和向下, 以驱逐所有黏附细胞。将电池悬浮在15毫升的锥形管上。 离心机所有样品在 500 x g 在室温下5分钟。 在1-2 毫升的 EGM2 中吸取上清和再悬浮细胞小球。将细胞悬浮液彻底混合, 取出小分 (20-40 μ l) 进行计数。 在细胞分和吸管10µL 上加入等量的台盼蓝到例。计算例的四主象限中的单元格数。注意: 使用例的两边都可以提高精确度。 清洗胶原涂层组织培养板, 这是准备在步骤 1.1.1, 两次与7毫升的 PBS。在第二次 PBS 洗涤后, 添加10毫升的内皮生长培养基 2 (EGM2) 培养基补充10% 胎牛血清的板块。 使用在步骤1.1.7 中获得的单元计数, 计算板 4 x 105单元所需的单元悬浮量。板 4 x 105 ECFCs 在步骤1.1.8 中制备的组织培养板上, 在一夜之间在37° c 和5% 二氧化碳 (CO2) 上孵育。 在实验之前, 将耗材存储在 4 °C 过夜 存储一个 3 “x 2” 金属板, 幻灯片 (保存在包中, 直到打开在遮光罩), 一盒无菌20升 (μ l) 提示, 和基底膜矩阵 (矩阵)。注: 该基质保存在-80 ° c, 用于长期贮存;总是在4° c 过夜或在使用前几个小时解冻。 确认计算机硬盘驱动器上的图像是否有足够的空间。注意: 使用本协议中概述的配置, 每个实验需要大约 60 gb 的空间 (4 gb/好)。但是, 空间估计是基于硬件配置的, 需要对每个系统都进行确定。 2. 协议 1: 实验设置: 准备幻灯片 收集和准备用品 在实验的当天, 收集在幻灯片上的电镀细胞的供应, 包括一桶冰, 一个小容器的干冰, 一对剪刀, 和一个20μ l 吸管。喷雾所有项目与70% 乙醇, 擦干与纸巾, 并放置在一个无菌组织文化罩项目。 收集所有储存在4° c (见步骤 1.2) 的物品, 包括金属板、小贴士、滑梯和基体。用70% 乙醇喷雾盒, 把盒子放在干冰容器里。注: 从4° c 的冰箱中取出矩阵, 只有当准备使用, 并始终保持在冰上的矩阵。 用70% 乙醇喷涂金属板, 并将其嵌入冰桶中的冰中。打开包含幻灯片的包, 将幻灯片放在金属板上, 使其保持冷。 将矩阵加载到幻灯片上 将吸管设置为10μ l, 然后用吸管将刀尖从冷端盒中取出。用剪刀将刀尖末端的大约1厘米切掉。注: 垂直于尖端, 以减少矩阵中的气泡。吸管可以设置为一个体积略大于10μ l, 以解释矩阵粘在内侧的尖端。 慢慢地把母体拉进吸管尖端。立即将吸管尖放在井的中心。轻轻地触摸吸管尖端到井底, 慢慢地推动矩阵出来。注: 不要超过吸管, 因为这将导致气泡形成。如果一个气泡形成, 弹出它立即使用一个小提示。 该幻灯片包含15个单独的井。对每个井重复前面的步骤。使用一个新的吸管尖端为每一个井保持一致性和减少基体凝固内的尖端。 一旦幻灯片装载了所有的井包含矩阵, 推动盖子所有的方式到幻灯片, 并孵育在37° c 30-60 分钟, 直到矩阵固化。注意: 不要让基体干燥。在孵化箱靠近滑梯的50毫升锥形管的盖子上加入一小卷 (2-3 毫升) PBS, 以降低基质干燥的风险。 3. 协议 2: 矩阵上的电镀 ECFCs 从组织培养皿中去除附着 ECFCs 并在悬浮液中收集 获得组织培养板包含 ECFCs 电镀前一天 (见第 1.1.9)。吸 EGM2 培养基和洗涤粘附 ECFCs 一次与7毫升 PBS。 吸入 PBS, 加入2-3 毫升的胰蛋白酶, 并孵育附着细胞2-5 分钟在37° c。 紧接着孵化, 添加3毫升的 EGM2 和吸管向上和向下, 以驱逐所有黏附细胞。将电池悬浮在15毫升的锥形管上。 重复步骤 3.1. 1-3. 1.3 为其余的三 ECFC 样品, 直到所有四细胞样品被收集在悬浮。 准备主混合 离心机所有样品在 500 x g 在室温下5分钟。 在1-2 毫升的 EGM2 中吸取上清和再悬浮细胞小球。 将细胞悬浮液彻底混合, 取出小分 (20-40 μ l) 进行计数。 在细胞分和吸管10μ l 上加入相等的部分台盼蓝到例。计算例的四主象限中的单元格数。注意: 使用例的两边都可以提高精确度。 使用上面的单元格计数, 计算包含 1.4×104单元格的每个单元格示例的卷。将所有细胞悬浮液彻底混合, 分 1.4 x 104细胞放入一个新鲜的试管中, 为每个实验条件准备一个主组合。添加 EGM2 介质, 使每个主组合的最终音量为175μ l。 混合每个主混合, 轻轻移和分50μ l 的主混合到个别井的幻灯片。注: 所有样品均为三份, 主混合料为3.5 口井, 以确保3口井有足够的容积。 孵化滑梯 在37° c 下孵化, 直到它可以被移动到显微镜室进行成像。注: 电镀和成像之间的时间应尽可能简短, 以限制在血管早期阶段的数据丢失。 4. 协议 3: 显微镜设置和图像采集 注: 对于我们的研究, 协议2和3是由不同的个人同时进行的。如果协议2和3必须由同一个人完成, 则应在上述协议4.2 之前完成协议3步骤4.1 和2。 打开显微镜和电脑 在开始实验前大约一到两个小时, 打开并预热舞台顶部孵化器至37° c, 将 CO2设置为 5%, 并将湿度设置为85%。填充恒温箱, 如果为空。 放置一个空的腔幻灯片在两个开放的位置之一, 并填写蒸馏水。安全的反馈温度计的房间温度控制, 如果可用。注意: 如果反馈温度计是可用的, 使用这种 “孵化温度” 来验证房间是否有平衡。 打开一个二次鼓风机设置为39-42 ° c 加热幻灯片从下面和最小化冷凝。 将第二张幻灯片添加为空白, 直到可以添加实验幻灯片。此幻灯片用作配置在安装过程中单个井的图像采集设置的位置占位符。 在第二张幻灯片的井周围的水库加水, 模拟成像实验中的条件。水井周围的水可以在显微镜设置和预热过程中对湿度进行评估。注意: 前级孵化器和二级鼓风机的预平衡对于维持稳定的培养环境至关重要。大多数活细胞室控制器提供温度实时反馈, CO2和湿度来评估系统的准备情况。在继续之前, 检查滑块上的湿度积聚和4.1.5 中填满的水库的过度干燥。如果室内有过多的干燥或冷凝, 可能需要调整湿度。为增加湿度, 添加湿巾和蒸馏水。为了减少冷凝, 无论是减少湿度设置4.1.1 调整, 或作为冷凝可能是低温的标志, 检查房间温度设置和二次鼓风机的位置。 在平衡期间配置基本的图像采集设置。注意: 图像采集是通过控制舞台、快门和摄像头的软件进行配置的。多维设置工具是配置软件的最简单方法。此外, 该软件将需要有自动对焦例程, 以确保重点控制在实验的持续时间。 使用该软件为每个井设置多个舞台位置。对于本协议, 选择井中心。 配置图像采集, 以便在每个阶段的位置, 整个井是成像。例如, 使用具有10-20% 图像重叠和大约 5 x 5 字段的 tilescan, 具体取决于相机和最终放大倍数。 每15分钟配置一次成像的时间间隔。注意: 使用本协议中概述的配置, 幻灯片的所有15口井都在15分钟间隔内进行成像。 加载实验幻灯片 在孵化室的平衡之后, 用实验幻灯片代替空白幻灯片。注: 一个平衡室将有稳定的温度, CO2, 和湿度至少20分钟。一旦实验幻灯片准备就绪, 就必须迅速完成步骤, 以尽量减少电镀与显微镜捕捉到的初始时间点之间的 “死时间”。此外, 为了便于比较成像实验, 这一次应该是一致的。在这些实验中, 协议3节4.3 中概述的所有步骤都需要大约30分钟才能完成。 移除滑动盖, 并将水添加到幻灯片上的油井周围的蓄水池中。注: 在成像实验期间, 盖子被移除。 配置最终图像获取设置 放置 CFI 计划氟 DL 10X 目标位置并选择冷凝器上的 Ph1 相环。以第一井为焦点, 调整 diascopic 光路为霍斯特·科勒照明和配置相位光学通过检查相环在冷凝器与目标相掩模的对准。 配置曝光时间并调整相位对比度的灯强度, 通常小于500毫秒。 循环通过在4.2.1 中设置的每个阶段位置, 并确认井的中心被选中, 并在必要时对其进行调整。 在每个阶段的位置, 关注的细胞镀在井中, 并设置舞台位置的 z 位置用于成像在软件。 测试显微镜的自动对焦机制。如果自动对焦是基于硬件的, 请确保它在所有舞台位置上都处于正确位置。注意: 由于试样和阶段在实验过程中会垂直漂移, 因此软件必须在每个阶段的位置和每一个时间点检查自动对焦, 以确保在时间过程中的可靠成像。如果可能, 在前一个时间点确定的自动对焦位置应该被用作随后的自聚焦例程的起始点。这样, 就可以轻松地调整正在进行的漂移。 减少或熄灭显微镜室的灯光, 开始成像实验。 5. 协议 4: 血管 (KAV) 的图像处理和动力学分析 将图像从单个时间点保存为每个井的图像堆栈注意: 大多数图像捕获软件都可以导出时间序列的多页 tiff (堆栈). KAV 设计用于处理可能包括多个时间点的数据集。因此, 对给定阶段位置的整个图像堆栈进行分析。如果需要, 图像处理软件可以从每个时间点导入单个图像, 以重建图像堆栈。 打开计算机上的图像处理软件 将 KAV 添加到图像处理软件 将 KAV 文件从文件夹拖到软件窗口底部的灰色栏中。单击 “保存” 将软件添加到列表中。 打开要分析的图像堆栈 单击图像处理软件中的下拉菜单中的 “文件” 然后 “打开”, 或将图像文件拖动到灰色条中, 如步骤5.3.1 中所示。 通过单击 “图像”、”类型”、”8 位”, 将图像转换为8位。 创建感兴趣的区域 (ROI) 通过单击工具栏中的 “分析” 打开 ROI 管理器。然后选择 “工具”, 然后是 “ROI 管理器”。 通过单击工具栏中的 “圆形” 或 “矩形” 选择工具, 并在图像上绘制所需的选择区域来创建新的 ROI。单击 “ROI 管理器” 窗口中的 “添加” 以保存该形状。注意: 通过将保存的 roi (zip 文件夹) 拖到 “拖放” 栏中以在 Manager 中打开, 可以打开以前创建的 ROI。 单击 roi 管理器中列出的 roi 标签以在图像上查看它。注意: 如果图像上不显示 roi, 则创建第二个 roi (任何大小/形状) 并将其添加到经理。一旦两个 roi 出现在列表中, 在两个之间单击来回, 所需的 ROI 将出现在图像上。 根据需要调整 ROI。一旦 ROI 在所需位置的图像上到位, 请转到菜单, 然后单击 “编辑”, 然后 “清除外部”。这将删除堆栈中每个图像的 ROI 之外的图像数据 (对于非矩形形状很有用)。注意: 如果您使用的是 rectangularly 形状的 ROI, 您也可以单击 “图像” 和 “裁剪”。 运行 KAV 软件 单击菜单栏中的 “插件”。 选择 “分析网络” 插件。这将打开一个带有选项的窗口, 以改变插件中的设置。 使用下拉箭头更改阈值方法。 选择所有适当的设置后, 单击 “确定” 以启动软件处理。注意: 通过 KAV 生成的骨架和掩码格式的可视化来确定适当的设置, 这表明了软件在相位对比度图像中从背景中识别和辨别单元和网络的精度。 保存 KAV 生成的数据 一旦插件完成了分析, 两个窗口将弹出在屏幕上, 包括一个数据表的数字值和一堆融合图像描绘骨架和面具格式副本。 通过导航到数据表的左上角并单击 “编辑” 然后 “复制” 或 “剪切” 将值粘贴到 excel 电子表格中来保存数值。 点击融合骨架和面具图像。通过单击 “文件”、”另存为” 和 “tiff”, 将融合的骨架/蒙版图像堆栈保存为带标记的图像文件格式 (tiff) 文件。 通过单击 “文件”、”另存为” 和 “TIFF”, 保存裁剪的相衬图像堆栈 (使用 ROI 创建)。 点击 roi 管理器窗口, 选择用于裁剪图像的 roi。单击 “更多”, 然后 “保存” 以保存 ROI 以备将来使用。注意: 使用相同的 ROI 将有助于在分析中保持一致性。