血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。
血液脳関門 (BBB) は、毒素や病原体循環から脳微小環境を保護し、脳の恒常性を維持する特殊なバリアです。バリアの主な場所はタイトジャンクショ細胞間と細胞膜に発現排出トランスポーター起因するバリア機能が脳の毛細血管の内皮細胞です。この関数は、ペリサイトおよび単位 (NVU) を形成しているアストロ サイトによって規制されています。脳卒中、アルツハイマー病 (AD) などいくつかの神経疾患脳腫瘍は BBB 機能障害に関連付けられます。BBB 透過性の評価は神経疾患の重症度と治療戦略を採用の成功の評価に重要なため。
いくつかのマウスに正常に適用されている堅牢な透磁率測定モデル遺伝的および実験両方まだここで単純なを提示します。メソッドは、定量性は一般的に適用される顕微鏡によるトレーサー蛍光分析と比較して客観的にです。このメソッドは、マウスはマウスを麻酔続いて水性の不活性蛍光トレーサーのミックスと腹腔内注入されます。動物の心臓の血流は、脳、腎臓や他の臓器を収穫する前に実行されます。臓器の均質化し、遠心上清からの蛍光測定が続きます。直前に灌流心臓穿刺から採血血管コンパートメントに正規化の目的提供しています。組織蛍光が量的に入手するぬれた重量および血清蛍光に正規化されたトレーサー透磁率インデックス。追加の確認のため蛍光可視化用トレーサー対側の半脳免疫組織化学のために保存を利用できます。
血液脳関門 (BBB) は、基底膜の鞘は、密接に関連するペリサイト (Pc)、および自分の終わり足の1 で基底膜を包むアストロ サイト (ACs) でサポートされている微小血管内皮細胞 (Ec) で構成されています ,2。ECs は、いくつかの細胞の種類をサポートし、主に ACs と Pc、バリア機能を調節すると対話も神経細胞とミクログリア、すべての一緒にユニットを形成、神経血管 (NVU)。NVU は、血液媒介性毒素や脳を入力してから病原体の輸送を制限する BBB の機能にとって重要です。この関数は、ECs ともトランスポーター p 糖タンパク質 (P ・ gp) その流出内皮を入力分子に戻すなどの操作のために存在するクローディン 5, オクルーディン, 精巣毛細血管-1, などタイト結合分子の結果1,ルーメン32,船。ただし、BBB は EC 膜1,2,3で表現される特定のトランスポーターで栄養 (ブドウ糖、鉄、アミノ酸) など重要な分子の輸送のためできます。EC 層は内腔 (血側) と特定とベクトル輸送機能報4,5 ように abluminal (脳向け膜) の間様々 なトランスポーターの分布に関して高偏極します。.BBB は中枢神経系の環境をしっかりと規制に関して保護、機能 BBB とパーキンソン病などの疾患に CNS ドラッグデリバリーのための大きな課題です。BBB 機能障害神経疾患でもバリア機能障害はアルツハイマー病 (AD) のように、例えば特定のトランスポーター ターゲットへの損傷を含めることができます、特に脳薬物送達が増加することを想定できません。広告で LRP1、怒り、P gp などいくつかのアミロイド β のトランスポーターが調節不全として知られている、無駄な6,7、8をかもしれないそれ故にこれらの運送者を対象とします。BBB は、ストローク、広告、髄膜炎、多発性硬化症と脳腫瘍9,10,11などのいくつかの神経疾患の障害です。治療戦略の重要な部分は、バリア機能を回復させる、従ってその評価は重要です。
この仕事については客観的かつ我々 正しく適用されているマウスのいくつかの行に両方実験的な遺伝子疾患モデル10,12,13 齧歯動物で透水性の試金のための量的なプロトコル ,14。メソッドは、血管コンパートメントからトレーサーを削除するマウスの灌流が続く蛍光トレーサーの単純な腹腔内注射に基づいています。脳や他の臓器が収集した記事の灌流および透水性の客観的評価と蛍光プレート リーダーで組織ホモジネートの測定に基づく絶対透磁率インデックス。組織ホモジネートまたは任意のトレースを受け取りません偽動物からの血清を使用して背景のすべての未加工の蛍光値が修正されます。十分な正規化は、血清量、血清蛍光組織、従って絶対と同等の実験と組織型との間にある透過性インデックスを降伏の重量に含まれます。グループ間の比較を容易にするため絶対浸透率のインデックス値容易に変換できる比率と我々 は以前に12を実行していた。同時に、ストアド ヘミ脳や腎臓に利用できる可視化トレーサー蛍光顕微鏡10。古典的な蛍光顕微鏡とはいえ面倒な切片と半定量分析のためのイメージの主観的な選択のために透磁率の地域差を取得する価値があります。プロトコルの詳細な手順が表示されます、適切な場所にノートが追加されます。これは、他の小動物にスケーリングすることができますマウスの体内透過性アッセイを正常に実行するために必要な情報を提供します。アッセイは、トレーサーの多くの種類に適用できる特異的な蛍光スペクトルとトレーサーの組み合わせによって透過性評価に基づいた料金とサイズを可能にします。
血液脳関門の機能障害は、プライマリとセカンダリの脳腫瘍や脳卒中を含む神経疾患の数に関連付けられます。BBB 破壊はしばしば命にかかわる中枢神経浮腫を関連付けです。開始の分子機構の解明や BBB の閉鎖したがって神経疾患一般の治療的意義の調査の研究者。ただし、調査方法は蛍光画像17,18の面倒で主観的な定量化に依存する技術的な問題…
The authors have nothing to disclose.
著者は、この作業を支援する Leduq 財団によって資金を供給 Sphingonet コンソーシアムを認めたいと思います。この作品も「血管分化と改造」共同研究センターによって支えられた (CRC/Transregio23、プロジェクト C1) と 7。FP、COFUND、ゲーテ国際ポスドク プログラム移動で、291776 号の資金。我々 はさらに処理および遺伝子型解析マウスと彼女のテクニカル サポートのキャサリン ・ ソマーを認めます。
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
384-well black plate | Greiner | 781086 | |
slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
microcentrifuge | eppendorf | 5415R |