Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

모든 동물 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 긴 대학교의 지침을 준수. 1입니다. 배양 기의 준비 95 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 0.35 m m KH2포4, 0.2 m m MgSO4 · 구성 된 배아 문화에 대 한 수정된 KSOM (mKSOM) 매체 준비 7 H2O, 1.71 m m CaCl2 · 2 H2O, 0.2 m m D (+)-포도 당, 0.2 m m 나트륨 Pyruvate, 1.0 m L-글루타민, 1.0 g/L Polyvinylpyrrolidone (PVP), 25.07 m m NaHCO3, 10 mM 나트륨 DL-젖 산, 페니실린, 0.05 g/L 및 0.05 g/L 살 균 물에 스. Hepes 버퍼 CZB (HCZB) 매체 81.5 m m NaCl, 4.8 m m KCl, 1.7 mM CaCl2 · 구성 된 배아 조작에 대 한 준비 2 H2O, 1.18 m m MgSO4 · 7 H2O, 1.18 m m KH2포4, 0.11 m m EDTA · 2Na, 36.1 m m 나트륨 DL-젖 산, 5.55 m D m (+)-포도 당, 0.025 g/mL 페니실린, 0.035 g/L 스, 0.014 m m 페 놀 레드, 1.0 g/L 폴 리 비닐 알코올, 5.0 m m NaHCO3및 20.0 mM Hepes 나트륨 소금 살 균 물에. Oocyte 활성화에 대 한 정품 인증 매체를 준비: mKSOM 매체와 50 nM TSA, 2mm EGTA, 5 µ g/mL cytochalasin B (CB), 5 mM SrCl2보충. 2. 준비의 이온 소 혈 청 알 부 민 (dBSA) 상 온 (12%의 최종 농도)에서 살 균 물 10 mL에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 1.2 g을 용 해. 부드러운 교 반으로 실내 온도에서 살 균 물에 BSA의 12%를 준비 위의 혼합된 이온 교환 수 지 구슬의 약 0.12 g을 추가 합니다. 구슬 파란색-녹색에서 색을 변경 하는 때 금, 복구는 피 펫을 사용 하 여 표면에 뜨는 솔루션. 다음 대체 구슬 신선한 것 들 (그림 1).참고: 구슬의 교체 일반적으로 한 번만 수행 됩니다. 아마도 완전 이온화를 몇 가지 교체를 필요합니다. 가이드, 구슬의 색상에서 그대로 하는 경우로 골드에 파란 녹색, 그것은 이온 교환이 완료 되 나타냅니다. 구슬 색상 변경 확인 솔루션을 복구 합니다.참고: 복구 솔루션 흐린 경우, 원심 (175 x g, 5 분) 필터 막힘을 방지 하기 위해. 복구 된 보충 10.5% NaHCO3의 250 µ L로 솔루션.참고:이 프로세스 dBSA 솔루션 중화 pH 조건에 대 한 것입니다. 그러나, NaHCO3 피할 수 있습니다. 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 상쾌한 소독 고 dBSA 재고 솔루션으로-20 ° C에서 저장 합니다. 3. oocyte 컬렉션 참고: 모든 마우스 빛 제어 및 에어컨을 갖춘 객실에서 유지 되었다. 슈퍼-배 란 각 여성 B6D2F1 마우스 (세 8-10 주) 임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬 (PMSG)의 7.5 IU의 복 주입 및 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 48 h PMSG 주사 후의 7.5 IU. 자 궁 경부 전위 14-16 h 여 안락사를 수행 hCG 주사 후. 복 부 생식로 표준 해 부 기법13를 사용 하 여 액세스를 incise합니다 간단히, 피부를 꼬 집 고 작은 측면 절 개는 중간에가 위. 단단히 위에 피부 절 개 아래 고 머리와 꼬리 쪽으로 피부를 당겨. 잘라가 위를 사용 하 여 복 막 하 고 밀어 용기의 코일 방식의 oviducts, 자 궁, 난소의 두 뿔의 존재를 확인 합니다. 작은 똑 바른가 위와 핀셋 oviducts extirpate, 표면 떨어져 피를 닦아 필터 종이. 미네랄 오일에는 oviducts를 설정 합니다. 그런 다음 절 개 바늘을 사용 하 여 수 란 관의 ampulla 잘라 고 적 운 oocyte 단지 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체의 200 µ L 상품에는 수 란 관의 ampulla에서 오는 이동 합니다. 지구 온난화 접시에 5 분 동안 품 어.주의: 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 10 분 이상 노출 된 oocytes에 대 한 해로운 것입니다. 적 운 세포 mKSOM 중간 포함 0.3 SA 일부 남은 적 운 세포 전송 두 번째 meiotic 분열 (MII) 무대 oocytes에는 stereomicroscope에서 적 운 oocyte의 단지에서 해제 됩니다 확인 하십시오. 그런 다음, 아래로 pipetting으로 MII 무대 oocytes 4 번 세척 (의 피 펫을 사용 하 여 < 100 µ m 내부 직경) mKSOM 중간 포함 0.3 SA 나머지 적 운 세포 분리에.참고: 작은 피 펫의 사용 적 운 세포의 분리를 촉진 한다. 37 ° C에서 5%에서 mKSOM 중간 포함 0.3 SA Mll 무대 oocytes를 품 어 enucleation까지 CO2 배양 기.참고:는 oocyte의 그것 보다 약간 큰 직경을 가진 작은 피 펫 것이 좋습니다. 4. 핵 이식 기증자 세포의 준비 단계 3.3-3.5, 후 denuded oocytes 적 운 oocyte 단지에서 격리 됩니다. 나머지 적 운 세포는 stereomicroscope 아래 피 펫을 사용 하 여 HCZB 보통 6 SA 0.1 %hyaluronidase HCZB 매체에 적 운 oocyte 단지에서 분산의 소량 (약 2 µ L)를 전송 합니다. SCNT에 필요한 때까지 37 ° C에서 지구 온난화에 6 SA HCZB 매체에 적 운 세포를 놓습니다.참고: 때 fibroblast 세포 (예., murine 태아 섬유 아 세포 세포)는 조직 배양 접시에서 세포를 분리 하 고 펠 릿으로 원심 기증자 세포로 사용. HCZB 매체 6 SA 포함 된 셀의 펠 릿 resuspend 5입니다. Oocytes enucleation 0.9 g PVP 10 mL HCZB 매체를 추가 하 여 9 %PVP 매체를 준비, 하룻밤 냉장고 (4 ° C), 및 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여 소독. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 5 mL에 CB의 5 mg을 추가 하 여 CB 재고 솔루션 (1 mg/mL의 농도)를 준비 합니다. HCZB 매체 (5 µ g/mL의 최종 농도)와 CB 재고 솔루션을 희석 하 고 enucleation 솔루션으로 사용 합니다. 흡입 및 멸 균된 피 펫을 통해 좀처럼 5 µ g/mL CB (enucleation 솔루션)를 포함 하는 HCZB 매체의 20 µ L에서 Mll 무대 oocytes를 세척 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에). 5 번 세척 절차를 반복 합니다. Enucleation 프로세스를 시작 하기 전에 enucleation 솔루션에서 지구 온난화에 약 10 분을 기다립니다. 그림 2A와 같이 enucleation 챔버를 준비 합니다. Mll oocytes enucleation 챔버 흡입 하 고 길게는 피 펫을 사용 하 여 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); enucleation 솔루션의 4 µ L를 배치 하 고 미네랄 오일 챔버 커버.참고: 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시의 커버를 사용할 수 있습니다. 스핀 들 및 현미경 (400 X) 실 온에서 MII 무대 oocyte의 염색체를 식별 합니다. 동양 발음 첫 극 지 몸, Mll 무대 oocyte는 스핀 들 및 염색체의 위치는 3 또는 9 시 micropipette를 들고 피 펫을 사용 하 여 (그림 2B) 위치.참고: 사용 하는 현미경 총에서 400 배 확대의 렌즈는. 또한, 목표 렌즈 한다 5 배 / 0.12과 40 X / 0.55 이다. Piezo 펄스 모는 피 펫의 zona pellucida의 빠른 드릴링 허용 합니다. 또한, 레이저 시스템 (예, XYClone) 압 전 구동 시스템 대신 zona pellucida 드릴링에 대 한 사용할 수 이기도 합니다. 3-6, 압 맥 박 강도 설정 하 고 운전 피 펄스 micromanipulation 피 펫 (7-8 µ m 내부 직경 평면 종단 팁)를 사용 하 여 zona pellucida 드릴. Zona pellucida에 구멍을 연 후 완전히 스핀 들 및 세포질 (그림 2C)의 최소한의 금액으로 염색체 enucleate.참고:이 프로세스 동안 oocytes 경향이 단단히 접시 바닥에 붙이거나 BSA14없이 매체 때문에 플라스틱. 10 분 이내 enucleation 프로세스를 완료 해야 합니다, 그리고 enucleated oocytes 인큐베이터에 반환. 적절 한 수 한 enucleation에서 조작할 수 있습니다 oocytes의 10와 20 사이입니다. Oocytes의 큰 배치 enucleation 절차 반복 됩니다. 가시광선 (그림 2C, 중간), 아래는 세포질에서 염색체의 부재를 확인 한 다음 0.3% dBSA CB 부족을 포함 하는 mKSOM 매체에 enucleated oocytes를 철저 하 게 세척 합니다. 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터에 접시 소개 셀 퓨전까지 CO2 .참고: 후 enucleation, ooplasm에서 제거 하는 세포질 포함 스핀 들 및 염색체. 6. 기증자 세포와 Enucleated Oocyte의 융합 HVJ-E의 준비 동결 건조 된 HVJ-E에 차가운 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션의 260 µ L를 추가 (키트, 참조 테이블의 재료) 및 플라스틱 아래로 완전히 중단 될 때까지.참고: 동결 건조 된 HVJ-E의 적절 한 금액은 한 병에 준비 하 고 260 µ L HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 키트에 포함 된다. 5 µ L aliquots HVJ E 솔루션을 준비 하 고 셀 퓨전까지-80 ° C에서 저장.주의: 그것 이기 때문에 온도 민감한 얼음, HVJ E를 신중 하 게 취급 합니다. 실험, 적절 하 게 압력솥 HVJ 전자 재료 및 컨테이너 바이러스 구성 요소를 완전히 비활성화를 완료 후 세포 융합 즉시 사용 하기 전에 셀 퓨전 버퍼의 20 µ L로 HVJ 전자 솔루션의 5 µ L를 희석. 장소 사용까지 얼음에 희석된 HVJ E 솔루션.참고: 셀 퓨전 버퍼 HVJ 전자 키트에 포함 되어 있습니다. 그림 3A와 같이 셀 퓨전 챔버를 준비 합니다. HCZB 매체는 피 펫을 사용 하 여 셀 퓨전 챔버 enucleated oocytes 전송 (안쪽 직경: 150 µ m 200 µ m에); 각 솔루션의 장소 4 µ L (9% 6%-BSA 기증자 세포, HVJ E 솔루션, HCZB 매체를 포함 하는 HCZB 매체 HCZB 매체에 PVP) 약 1 mL의 미네랄 오일와 챔버 커버.참고: 적절 한 수 한 셀 퓨전 절차 동안 조작에 대 한 상공 회의소에 전송 되는 enucleated oocytes의 5에서 30입니다. Oocytes의 큰 배치, 셀 퓨전 절차 반복 됩니다. 챔버, 대신 60 mm 페 트리 접시 커버를 사용할 수 있습니다, 사용할 수 있는 경우. HCZB 매체 400 X magnificationat 실 온에서 현미경 아래에 enucleated oocytes를 놓습니다. 기증자 세포 (6-7 µ m 내부 직경 평면 종단 팁), micromanipulation 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 셀 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션으로 추방. 다음에 분리 될 것 동등 하 게 서로 다른 직렬 세포 융합을 활성화 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 적 운 세포 하나 하나 발음. HCZB 중간 지주 피 펫을 사용 하 여 enucleated oocytes를 하십시오. Micromanipulation 피 펫 piezo 펄스 (2-3의 3-6, 속도의 강도)와 zona pellucida 드릴. Zona pellucida에 구멍을 연 후 oocyte 멤브레인을 거치지 않고 볼륨 5 번 적 운 세포의 볼륨 HVJ 전자 서 스 펜 션 솔루션 함께 oocyte 막에 단단히 적 운 세포를 놓습니다.참고: 적 운 세포에 대 한 6-7 µ m 내부 직경은 평면 종단 팁 micromanipulation 펫의 준비. 펫 부드러운 셀 출시를 유지 하기 위한 9 %PVP 매체를 사용 하 여 정기적으로 세척 되어야 한다. 단계 6.2.3-6.2.5 10 분 안에 완성 해야 합니다 또는 세포 융합의 효율 낮은 것 이다. HVJ-E의 막 융합 활동 압력가 마로 소독, 세제, 또는 70% 에탄올 치료에 의해 비활성화 됩니다. 실험 후 HVJ E 솔루션의 적절 하 게 삭제 수 해야 합니다. 세포 융합의 조작, 후 즉시 mKSOM 중간 포함 0.3 SA, oocytes는 전송 고 37 ° C에서 5%에서 인큐베이터로 이동 1 h의 CO2 . 7. 재건축된 Oocytes 및 Trichostatin A 치료와 비타민 C의 활성화 TSA의 준비 5mm TSA 솔루션 3 µ L aliquots로 분배 하 고-20 ° c.에 솔루션 저장 DMSO (12.5 µ M의 농도)의 1 mL에 5mm TSA 재고 솔루션의 2.5 µ L를 추가 합니다. 12.5 µ M TSA 재고 솔루션 활성화 매체 mKSOM 매체의 2 ml에서의 8 µ L를 희석 (50의 최종 농도 nM). VC의 준비 메 마른 내 무료 물 1 mL로 VC의 1 밀리 그램을 추가 하 고-20 ° c.에 저장 MKSOM 매체 (10 µ g/mL의 최종 농도) VC 재고 솔루션을 추가 합니다. 재건축된 Oocytes의 활성화 셀 퓨전 후 1 시간 조기 염색체 응축 (PCC) 재건축된 oocytes (그림 3B)에서 현미경 (400 X)를 사용 하 여 확인 합니다. 정품 인증 매체를 재건축된 oocytes를 전송 (1.3 단계 참조) TSA를 포함 하 고 37 ° C에서 5%에서 6 h에 대 한 품 어 CO2 공기 (그림 3C). SCNT 배아에서 프로-핵의 형성을 관찰 후 2 mKSOM 중간 포함 0.3 SA (그림 2C)에 TSA 치료의 더 많은 시간을 적용. MKSOM 보통 VC 보충 TSA 치료 배아를 전송 및 그림 3D와 같이 7 h에 대 한 품 어. VC 치료의 7 h 후 mKSOM 중간 포함 0.3 SA, VC 치료 배아를 전송 하 고 37 ° C에서 5%에서 4 일 동안 품 어 공기에 CO2 .참고: 복제 된 생쥐를 생산, 형태학 상으로 정상적인 2 세포 단계 태아에 전송 oviducts 의사 임신 여성 쥐 (MCH(ICR)) 질 플러그 (pseudopregnancy의 하루 0.5)15를 발견 하는 날에. 19.5 일 후 이식 사이트 및 신생아의 수는 제왕 절 개 후 기록 됩니다.