Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио
Summary
Здесь мы представляем протокол проявить, как ячейки photoconversion достигается за счет УФ-облучения в конкретные районы, выражая флуоресцентный белок, Eos, в живых животных.
Abstract
Животных и растительных тканей состоит из отдельных популяций клеток. Эти клетки взаимодействуют со временем для построения и поддержания тканей и может вызвать болезнь, когда нарушена. Ученые разработали умные методы расследования характеристики и естественную динамику этих клеток в неповрежденной ткани выразить флуоресцентных белков в подмножества ячеек. Однако время от времени, эксперименты требуют более выбранных визуализации ячеек в ткани, иногда на одну ячейку или населения клетки образом. Для достижения этой цели и визуализации единичных клеток внутри населенность клеток, ученые использовали одну ячейку photoconversion флуоресцентных белков. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы покажем здесь как прямой свет УФ Eos выражая ячейку интереса к нетронутым, живущих у рыбок данио. Мы затем изображение те клетки Eos+ photoconverted 24 h позже определить, как они изменили в ткани. Мы описываем две техники: Одноместный клеток photoconversion и photoconversions населения ячейки. Эти методы могут использоваться для визуализации ячеек взаимодействий, клетки судьба и дифференциации и миграции клеток, делает его технику, которая применима в многочисленных биологических вопросов.
Introduction
Несколько отдельных ячеек взаимодействуют для создания и поддержания сложных тканями растений и животных. Эти клетки часто вставными и трудно отличить от соседей на уровне отдельной ячейки без микроскопия высокого разрешения, которые требуют фиксации ткани. Однако, чтобы понять, как эти формы тканей, поддерживаются и стать больными, он был необходимым расследовать как сингл клеток в тканях, взаимодействующих с течением времени. В идеале эти эксперименты требуют маркировки единичных клеток в тканях неинвазивным способом без требования о фиксации. Теперь ученые разработали многочисленные методы для выполнения этой задачи1,2,и3,4.
Обнаружение и осуществление медузы Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) был один интересный подход, который позволил для маркировки отдельных клеток в тканях окружающей среды1. С помощью конкретных клеток промоутеров, возможна генетически выбрать подмножество ячеек, которые помечены как1. В качестве альтернативы вирусный индуцированных выражение гена GFP могут быть использованы для выбранного пользователем выражение гена GFP3,4. Хотя довольно полезным, генетических опосредованной выражение гена GFP не позволяют выбранного пользователем выражение в рамках подмножества клеток в тканях; и вирусный выражение GFP, хотя и выгодно, может быть инвазивными. С появлением производных GFP и умные методы как Brainbow выразить собственный флуоресцентные белки более редко в тканях стало возможным для визуализации единичных клеток и их взаимодействия в сложных ткани2, 5. Однако, эти подходы ярлык клетки случайным образом. Если нужный эксперимент требует визуализации одну ячейку или популяция клеток, определяемое экспериментатора, они таким образом ограничены. С таких экспериментов, было бы целесообразно иметь генетически выраженной флуоресцентный белок, который можно манипулировать, чтобы отличать, в одну ячейку моды, это от других флуоресцентные и не люминесцентные клеток.
Для достижения этой цели и визуализации клеточной биологии одиночных камер в сложных живых тканей, научное сообщество использует одну ячейку photoconversion собственный флуоресцентные белки6,,78. С помощью генетически контролируемых экспрессии белка photoconvertible (то есть, eos, Каэдэ и т.д.), который переходит от зеленых красных флуоресцентных состояние при воздействии УФ (488 нм) света, мы можем выделить одну ячейку от его дневно обозначенные соседи6,,78. Этот подход использует аппарат придает нашей Конфокальный микроскоп, который может направить свет от стека Лазерный дифракционный региона интерес. С этой техникой мы можем либо ярлык отдельные ячейки или больших популяций в форме, определяемой пользователем9,10,11. Методика является минимально инвазивной по сравнению с одной ячейке инъекции вирусных GFP. Как доказательство концепции мы показываем, что мы можем photoconvert отдельные ячейки в пределах ганглия в периферической нервной системы и photoconvert больших популяций как клетки, расположенные на вентральной стороне спинного9,10, 11,12. Затем мы можем визуализировать эти photoconverted клеточных популяций 24 часа позже, чтобы разобраться в их передвижения и дифференциация во время разработки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В сложных тканей различные типы клеток организовать в конкретных областях. Недавно были использованы методы для метки отдельных ячеек в этих больших ткани структур1,2,3. Здесь мы показываем, два метода, которые аналогичным образом могут…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бернард Kulemaka и члены лаборатории Смит за их полезные комментарии и руководство реагента, Sam Connell и Brent Redford 3i для Филдинг изображений вопросы и Дебора Bang, Карен прислушаться и Кей Стюарт для данио рерио ухода. Эта работа была поддержана в Университете Нотр-Дам, Элизабет и Майкл Галлагер семьи, Альфред P. Sloan фонд, центр данио рерио исследований в Университете Нотр и центр стволовых клеток и регенеративной медицины в Университете Нотр Дама. Все исследования на животных были сделаны в соответствии с Университет Нотр-Дам IACUC доктор Коди Смит.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
