Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.
Abstract
רקמה חיה and הצומח מורכב של אוכלוסיות שונות של תאים. תאים אלה אינטראקציה לאורך זמן לבנות ולתחזק את הרקמה והוא יכול לגרום לטטנוס כאשר משובשות. מדענים פיתחו טכניקות חכם כדי לחקור את המאפיינים ואת הדינמיקה הטבעית של תאים אלה בתוך רקמת ללא פגע על ידי הבעת פלורסנט חלבונים בתוך קבוצות משנה של תאים. עם זאת, לעתים, ניסויים דורשים יותר שנבחר ויזואליזציה של תאים בתוך הרקמה, לפעמים על האופן תא בודד או אוכלוסייה-של-תאים. כדי להשיג זאת דמיינו תאים בודדים בתוך אוכלוסייה של תאים, נעזרו מדענים photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט. להפגין טכניקה זו, אנו מציגים כאן כיצד לכוון אור UV לתא Eos-הבעת התעניינות שלם, חי דג זברה. אנחנו מכן תמונה באותם תאים Eos+ photoconverted 24 שעות מאוחר יותר כדי לקבוע איך הם שינו ברקמה. אנו מתארים שתי שיטות: יחיד תא photoconversion ו- photoconversions של אוכלוסיות של התא. שיטות אלה ניתן להמחיש אינטראקציות תא-תא, תא-גורל בידול, ואת נדידת תאים, הפיכתה טכניקה הרלוונטיים בשאלות ביולוגיות רבות.
Introduction
תאים נפרדים מרובים אינטראקציה לבנות ולתחזק מורכבים רקמות. תאים אלה הם לעתים קרובות intercalated, שקשה להבדיל בין שכנים ברמה תא בודד ללא מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הדורשים קיבוע של רקמות. עם זאת, כדי להבין כיצד אלה הטופס רקמות, מתוחזק, ולהיות חולה, זה היה חיוני לחקור איך חד תאים בתוך הרקמה אינטראקציה לאורך זמן. באופן אידיאלי, ניסויים אלה דורשים תיוג של תאים בודדים בתוך רקמה בצורה לא פולשנית ללא הדרישה של קיבעון. כעת, מדענים פיתחו טכניקות רבות כדי להשלים את המשימות1,2,3,4.
לצורך גילוי והיישום של החלבון הניאון מדוזה ירוק (GFP) היה אחד גישה מרגש המותר עבור תיוג של תאים נפרדים ב- הסביבה הרקמה1. באמצעות תאים ספציפיים היזמים, זה אפשרי לבחירת גנטית בתאים המסומנות1. לחלופין, ביטוי מושרה ויראלי של GFP יכול להיות מנוצל עבור המשתמש שנבחר ביטוי של GFP3,4. למרות שימושי למדי, הגנטי בתיווך של GFP אינה מאפשרת המשתמש שנבחר הביטוי בתוך קבוצת משנה של תאים בתוך הרקמה; וניתן ביטוי נגיפי ה-GFP, למרות יתרון, פולשני. עם כניסתו של GFP נגזרים וטכניקות חכם כמו Brainbow לבטא חלבונים פלורסנט ברורים יותר בדלילות בתוך רקמות, זה הפך אפשר לדמיין תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם רקמות מורכבות2, 5. עם זאת, גישות אלה תווית תאים באופן אקראי. אם הניסוי הרצוי דורש ויזואליזציה של תא בודד או אוכלוסיית תאים אשר מוגדרת על ידי הנסיין, הם לכן מוגבל. עם ניסויים כאלה, זה יהיה יתרון יש חלבון פלואורסצנטי ביטוי גנטית אפשר לגרום להם להבחין, באופן תא בודד, זה של תאים אחרים פלורסנט, הלא-פלורסנט.
כדי להשיג מטרה זו, ולהמחיש את ביולוגיה של התא של תאים בודדים בתוך רקמת החיים מורכבים, הקהילה המדעית משתמש photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט ברורים-6,–7,–8. באמצעות גנטית מבוקר הביטוי של photoconvertible חלבון (קרי, eos, קאךה, וכו ‘) זה המעברים מ ירוקה למצב ניאון אדום כאשר הם נחשפים UV (488 ננומטר) אור, אנחנו. יכולים להבחין תא בודד מן שלה שכותרתו fluorescently השכנים6,7,8. גישה זו מנצל מכשירים המחוברים שלנו מיקרוסקופ קונפוקלי אשר יכולים לכוון את האור מאוסף לייזר לאזור מוגבל עקיפה של עניין. בטכניקה זו, אנו יכולים גם תווית תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות צורה על-ידי המשתמש9,10,11. הטכניקה היא פולשנית בהשוואה לתא בודד זריקות של נגיפי ה-GFP. מהווה הוכחה של המושג, אנחנו מראים שאנחנו יכולים photoconvert תאים בודדים בתוך גנגליון מערכת העצבים ההיקפית, photoconvert אוכלוסיות גדולות יותר כמו תאים ממוקם על הצד הבטני של חוט השדרה9,10, 11,12. אנחנו מכן יכול לדמיין photoconverted תא אוכלוסיות אלה 24 שעות מאוחר יותר כדי לזכות בתובנה שלהם התנועה ובידול במהלך הפיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
ברקמות מורכבות, סוגי תאים נפרדים לארגן לתחומים ספציפיים. לאחרונה כבר מנוצל טכניקות תווית בתאים בודדים בתוך אלה רקמות גדולות מבנים1,2,3. כאן נדגים שתי טכניקות באופן דומה יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תא בודד אינטראקציות והן תא אינטראקציות הא?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ברנרד Kulemaka וחברי המעבדה סמית שלהם הערות מועילות והדרכה ריאגנט, סאם קונל, ברנט רדפורד של 3עכשיו עבור פילדינג הדמיה שאלות, דבורה באנג, קארן הקשבה, קיי סטיוארט לטיפול דג זברה. עבודה זו נתמך על ידי את אוניברסיטת נוטרה דאם, האליזבת, מייקל משפחה, אלפרד פ סלואן קרן, מרכז מחקר דג זברה אוניברסיטת נוטרה, מרכז של תאי גזע, רפואה רגנרטיבית-אוניברסיטת נוטרה דאם. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל נעשו בהתאם אוניברסיטת נוטרה דאם IACUC ד ר קודי סמית.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
