Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie
Summary
Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.
Abstract
Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos+ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.
Introduction
Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant développé de nombreuses techniques pour accomplir cette tâche1,2,3,4.
La découverte et la mise en œuvre de la protéine fluorescente méduse verte (GFP) était une approche passionnante qui a permis pour l’étiquetage des cellules distinctes dans un tissu environnement1. À l’aide de promoteurs spécifiques des cellules, il est possible de sélectionner génétiquement un sous-ensemble de cellules qui sont étiquetés1. Alternativement, expression induite virale de GFP peut être utilisée pour expression sélectionné par l’utilisateur de GFP3,4. Bien que très utile, expression génétique de médiation de GFP ne permet pas d’expression sélectionné par l’utilisateur dans un sous-ensemble de cellules dans les tissus ; et l’expression virale de GFP, bien qu’avantageuse, peut être envahissante. Avec l’avènement des dérivés de la GFP et habiles techniques comme Brainbow pour exprimer les protéines fluorescentes distinctes plus faiblement dans les tissus, il est devenu possible de visualiser les cellules individuelles et les interactions entre eux en tissu complexe2, 5. Toutefois, ces approches étiqueter les cellules de façon aléatoire. Si l’expérience désirée exige la visualisation d’une seule cellule ou d’une population de cellules qui est définie par l’expérimentateur, elles sont donc limitées. Avec de telles expériences, il serait avantageux d’avoir une protéine fluorescente génétiquement explicite qui peut être manipulée pour distinguer, d’une façon unique cellule, d’autres cellules fluorescentes et non fluorescent.
Pour atteindre cet objectif et visualiser la biologie cellulaire de cellules individuelles au sein d’un tissu vivant complexe, la communauté scientifique utilise seule cellule photoconversion distinctes de protéines fluorescentes6,7,8. Vous utilisez génétiquement contrôlé d’expression d’une protéine et (c.-à-d., eos, kaede, etc.) qui passe du vert au rouge État fluorescente lorsqu’ils sont exposés aux UV (488 nm) léger, on distingue une seule cellule de ses fluorescent étiquetés voisins6,7,8. Cette approche utilise un appareil attaché à notre microscope confocal qui peut diriger la lumière d’une pile de laser à une région limitée par la diffraction d’intérêt. Avec cette technique, nous pouvons soit l’étiquette cellules individuelles ou des populations plus importantes dans une manière définie par l’utilisateur9,10,11. La technique est peu invasive par rapport à des injections de cellule unique de GFP virale. Comme une preuve de concept, nous montrons que nous pouvons photoconvert des cellules individuelles au sein d’un ganglion dans le système nerveux périphérique et de la photoconvert des populations plus importantes comme les cellules situées sur la face ventrale de la moelle épinière9,10, 11,12. Ensuite, nous pouvons visualiser ces populations de cellules photoconverted 24h plus tard pour avoir un aperçu de leur mouvement et de la différenciation au cours du développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus comple…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Smith pour leurs commentaires utiles et les conseils de réactif, Sam Connell et Brent Redford de 3i pour mise en service d’imagerie questions et Deborah Bang, Karen Heed et Kay Stewart pour les soins de poisson-zèbre et Bernard Kulemaka. Ce travail a été soutenu par l’Université de Notre Dame, le Elizabeth et Michael Gallagher Family, l’Alfred P. Sloan Foundation, Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de notre-Dame et le Centre des cellules souches et médecine régénérative à l’Université de Notre Dame. Toutes les études animales ont été effectuées dans le respect de l’Université de Notre Dame IACUC au docteur Cody Smith.
Materials
| Tg(sox10:eos) zebrafish animals | Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame | ||
| 100 X 15 mm petri dish | VWR | 25384-302 | |
| Embryo medium | Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock. | ||
| 0.8% Low Melting Point Agarose | dot scientific inc | 9012-36-6 | |
| 35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish | Ted Pella Inc. | 14021-20 | |
| Needle dissecting probe | |||
| 0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) | Fluka analytical | A5040-250G | |
| Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters | Zeiss Axiozoom | ||
| Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets | 3i spinning disk confocal | ||
| UV light source (laser) for photoconversion | 405 nm laser | ||
| Slidebook software | 3i | ||
| Methylene blue | Kordon |
Referências
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
- Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
- Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
- Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
- McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
- Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
- Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
- Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).
