Normalisée de mesure de différence de potentiel transépithélial Membrane nasale (NPD)
Summary
Nous présentons ici un protocole standardisé permettant de mesurer la différence de potentiel nasale (NPD). Régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et fonction (ENaC) de canal sodium épithélial sont évalués par la variation de la tension à travers l’épithélium nasal après une perfusion de solutions qui modifient l’activité des canaux ioniques, fournissant une mesure des résultats.
Abstract
Nous décrivons une mesure normalisée de la différence de potentiel nasale (NPD). Dans cette technique, régulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et la fonction du canal (ENaC) sodium épithélial sont surveillés par la variation de tension à travers l’épithélium nasal après la surfusion de solutions qui modifient des canaux ioniques activité. Cette option est activée par la mesure de la différence de potentiel entre le compartiment sous-cutanée et l’épithélium des voies respiratoires dans la narine, en utilisant un cathéter en contact avec le cornet nasal inférieur.
Le test permet de mesurer la tension de la ligne de base stable et les changements successifs de tension net après la perfusion de 100 µM amiloride, un inhibiteur de la réabsorption de Na+ dans une solution de Ringer ; une solution sans chlorure contenant l’amiloride à la sécrétion de chlore en voiture et 10 µM isoprotérénol dans une solution sans chlorure d’amiloride pour stimuler l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-conductance chlorure dépendants associés à CFTR.
Cette technique a l’avantage de démontrer les propriétés électrophysiologiques des deux principales composantes établissant l’hydratation du liquide surface des voies aériennes de l’épithélium respiratoire, ENaC et CFTR. Par conséquent, c’est un outil de recherche utile pour la phase 2 et une preuve d’essais d’agents qui ciblent l’activité CFTR et ENaC pour le traitement des maladies pulmonaires de la mucoviscidose (CF). C’est également une procédure de suivi clée pour établir la dysfonction CFTR lors de tests génétiques et tests de la sueur sont équivoques. Contrairement au chlorure de sueur, le test est relativement plus chronophage et coûteux. Il exige aussi la formation des opérateurs et l’expertise pour effectuer le test efficacement. La variabilité inter – et intra – subject a été signalée dans cette technique, en particulier chez les sujets jeunes ou peu coopératifs. Pour aider à cette préoccupation, interprétation a été améliorée grâce à un algorithme récemment validé.
Introduction
L’objectif général de cette méthode est de mesurer la différence de potentiel nasale (NPD) dont l’objectif est d’enquêter sur les trans-épithéliales ion transport in vivo1. Cette technique permet la mesure de sodium (Na+) et transport de chlorure (Cl–). NPD a été utilisé comme un outil de recherche depuis la fin des années 1980 et a été accepté en 1998 comme une procédure de diagnostic de la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) consensus statement2 et en 2017 dans les recommandations Diagnostic de Consensus Cystic Fibrosis Foundation (CFF) 3. en effet, un dysfonctionnement du CFTR biologique, qui est la cause des FC, est attestée par une absorption accrue de Na+ à la membrane apicale et un défaut de sécrétion de Cl– . Ce test fonctionnel offre l’avantage d’un outil de diagnostic supplémentaires lorsque génétique est non concluante chez les patients atteints de résultats test sueur intermédiaires pour une période indéterminée3. Bien que ces renseignements peuvent également être obtenus par biopsies intestinales de mesure actuel (ICM), ICM est, cependant, seulement disponible dans quelques centres dans le monde et a besoin encore de normalisation. NPD n’est plus disponible dans environ 60 centres mondiaux et, en outre, cible de l’épithélium respiratoire qui est le lieu principal de la maladie.
Compte tenu des informations qu’il fournit sur l’activité CFTR, il est également utilisé dans la validation des études visant à évaluer la restauration fonctionnelle de la protéine CFTR par modulateur thérapies4,5,6,7, 8. En effet, les données provenant d’études d’édition d’ARNm/gène CFTR, potentialisateur CFTR, correcteur de thérapie, mettre en évidence des changements significatifs dans la Cl– et Na+ de transport avec thérapie6,9 et confirme que le NPD peut être un point de terminaison réactive dans les essais cliniques. Comme nous n’avons pas des paramètres cliniques sensibles capables de détecter un changement subtil dans l’état clinique du patient à court terme, ce biomarqueur préclinique peut être très instructif. Le domaine des thérapies de modulateur CFTR élargit rapidement et nous avons urgemment besoin des tests in vivo qui sont capable de déchiffrer rapidement les composés actifs avant d’aller au grand phase 3 des essais10.
Les raisons physiologiques de la technique sont basée sur la mesure de la différence de potentiel entre l’épithélium pulmonaire dans la narine et le compartiment sous-cutanée. Activités de canal d’ion sont explorées en mesurant la différence de potentiel de référence maximale stable (DP), ses changements après que l’ENaC de blocage liée à l’absorption Na+ et conduire la sécrétion de Cl– par l’intermédiaire de différents transporteurs apicales de Cl– y compris CFTR. Dysfonctionnement CFTR témoigne d’un changement minime dans la différence de potentiel lors de la stimulation de la sécrétion de Cl– par une voie dépendante de cAMP et un accroissement ENaC médiée par absorption de Na+ tel que détecté par une différence de potentiel plus négative de base et une réponse accrue à l’amiloride. La base mécaniste pour FC contre PD normale est résumée dans la Figure 1.
Figure 1 : Figure Sommaire de l’activité des canaux ioniques. Ion (A) dans l’épithélium respiratoire, ce qui démontre l’activité équilibré de l’activité de l’ENaC et CFTR chez les sujets normaux et (B) perte d’activité CFTR, résultant en ENaC véhiculée par le transport de sodium et ont réduit les dépendant chlorure CFTR transport. ENaC : canal sodique épithélial, Na+: sodium, CFTR : régulateur transmembranaire de la fibrose kystique, CL–: chlorure, mV : millivolts, PD : différence de potentiel, min : minutes/s s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Cependant, cet essai démontre une certaine variabilité aussi bien à des mesures répétées au sein d’un même patient et chez les patients présentant le même génotype. C’est extrêmement important de faciliter l’interprétation des changements après le traitement du modulateur. Par ailleurs, nous manquons encore seuils validés toute discrimination entre les FC et sujets sains. Cela peut être partiellement en raison des différences entre la disponibilité des installations cliniques et des techniques employées. Par conséquent, un considérable effort international visant à la standardisation de l’essai est en cours. Fois la nous CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) et la CTN-ECFS (European Cystic Fibrosis Society-réseau d’essais cliniques) créé un NPD procédures d’utilisation normalisées (SOP) pour l’utilisation dans les essais multicentriques et de la recherche. Ce récent travail collaboratif par le CTN et TDN a entraîné un POS combiné, international, réunissant l’expertise de la CTN et TDN (2014)11. Cet article présente les techniques de protocole et test d’employer le NPD pour le CF diagnostic ou pour des essais de validation menée à l’initiative. Chaque centre de mise en œuvre de la technique est responsable de l’application à son Comité d’éthique de recherche humaine institutionnelle pour approbation.
Figure 2 : schéma d’ensemble recommandé d’installation NPD. Notez que la configuration recommandée est indiquée, y compris les pompes à perfusion séquentielle et la configuration de série de 4-robinet d’arrêt. Les connexions spécifiques et des exemples de composants sont indiqués dans le pos. (Diagramme modifié avec la permission de Solomon, G.M., poitrine, 2010,13) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Le flot expérimental est décrit dans la Figure 2, selon laquelle le NPD est mesurée entre le pont Explorer positionné sur le pont d’épithélium de surface et de référence placé dans l’espace sous-cutané, tous deux reliés aux électrodes et une haute impédance voltmètre.
C’est assurée par 2 systèmes différents : il y a 2 configurations d’électrode de référence acceptable : (i) équilibré des électrodes Ag/AgCl et un pont de crème électrocardiogramme (ECG) connecté à l’espace sous-cutané par abrasion légère ou (ii) saturée au calomel au calomel et une gélose rempli de calibre 22 à 24 aiguilles introduites par voie sous-cutanée. Le contact avec la muqueuse nasale est activé par un cathéter à double lumière. Un lumen est rempli d’agar ou de la crème de l’ECG et connecté à l’électrode de mesure, l’autre permet la perfusion sur la muqueuse nasale des solutions différentes.
L’extrémité de la tubulure explore est placée dans la muqueuse respiratoire sous l’inférieur nasal cornet (Figure 3).
Figure 3 : Placement d’explorer la tubulure sur la muqueuse respiratoire. Placement de projection (A) vue externe. (B) Rhinoscopic vue illustrant de placement. (C) Diagramme indiquant l’emplacement anatomique pour le placement de cathéter. PD : différence de potentiel
Pour étudier la réponse du PD à plusieurs médicaments, les solutions superfusion sont appliquées via la deuxième lumière du cathéter. Il y a plusieurs étapes clés concernant la préparation et la conduite des mesures NPD, qui sont détaillées ci-dessous dans le protocole, de la préparation initiale grâce à l’analyse des données.
Après la préparation des solutions et des électrodes, des tests de qualité adéquate des électrodes et sondes permettant la conduite de base du test. Basales sont effectuées le long de l’inférieure cornet, qui permet de sélectionner le meilleur endroit pour la mesure, généralement que les méthodes de mesure plus négatif. Puis les perfusions séquentielles déterminent Na+ (ENaC) et Cl– flux ionique (CFTR-dépendante) via une modification de la tension à travers l’épithélium nasal.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo, le NPD fournit une mesure unique qui peut être effectuée à plusieurs reprises de manière longitudinale et montre qu’avec des mesures répétées, des résultats de longitudinales similaires sont observés sur une base individuelle et plus14, 15. Il y a des preuves solides que le NPD a validité excellente discrimination permettant de distinguer les CF de non-CF. 25 études a constamment démontré une différence statistiquement significative en Cl– et la conductance Na+ entre les patients fibro-kystiques et témoins sains10. Alors que plusieurs indices développés auparavant démontrent cette capacité, nous prévoyons que les nouvelles mises à jour sont nécessaires compte tenu des récentes standardisations de méthodologie7,8.
Modifications et dépannage
Ce test nécessite plusieurs étapes clés afin d’assurer des mesures exactes. Cela inclut l’offset de boucle fermée de cathéters et électrodes pour s’assurer que le système fonctionne aux normes recommandées. Patients doivent rester immobile et s’abstenir de parler comme cela minimise les artefacts et le délogement de cathéter. Cela rend l’épreuve difficile chez les patients non coopératifs et la technique n’a été signalée que dans une étude chez les enfants de moins de 6 ans d’âge7.
Inspection préalable de l’épithélium nasal est nécessaire pour s’assurer qu’il n’y a pas de croûtes ou mucus sur l’épithélium, qui peut affecter les mesures.
C’est très important, il doit souligner que l’emplacement de la mise en place du cathéter est l’objet de débats. Le SOP présentée ici utilise la mesure sous le cornet inférieur (IT). La mise en place du cathéter sous l’il a été normalisé et menée en essais multicentriques et, par conséquent, c’est la technique recommandée. Mesure sous l’il est effectué avec le cathéter de trous latéraux, qui peut-être être difficile à maintenir en contact avec la muqueuse nasale, tout en étant en contact avec les solutions. Autres groupes peuvent mesurer la DP sur le plancher nasal, qui est techniquement plus facile. Ce qui est important, Vermeulen (2011) ont démontré que les 2 méthodes sont comparables16.
Le réchauffement des solutions reste un sujet de débat entre européens et US-centers17,18. Elle a été préconisée que l’utilisation de solutions à 37 ° C au lieu de 22 ° C améliore la réponse observée chlorure total d’environ 25 % et la réponse dépendante de l’isoprotérénol chlorure par environ 95 % de18. Cependant, le réchauffement augmente la variabilité, tel qu’évalué par un plus grand écart-type de la réponse de chlorure total17. Par conséquent, comme les solutions le réchauffement est un facteur supplémentaire de variabilité, il est conseillé ne pas pour réchauffer les solutions à moins que requis sur une base de l’étude.
Nous avons déjà comparé les deux techniques de l’électrode et trouvé que l’AgCl et le Calomel systèmes d’électrodes de manière semblable dans des courants basales et stimulées dans les sujets normaux,13.
Limites de la technique
Ce test est soumise à une variabilité intra-sujet significative. La variabilité de la notation est particulièrement répandue chez les patients avec des tracés pour une durée indéterminée et cela doit être comptabilisé en application de diagnostic19. Facteurs de variabilité comprennent l’infection des voies respiratoires aiguës, des polypes nasaux, chirurgie des sinus préalable et l’inflammation associée à la FK, qui diminuent sa spécificité et sensibilité20,10. En outre, interprétation des tracés peut-être différer entre les lecteurs, bien que les lecteurs experts démontrent excellent accord de notation quantitative et l’interprétabilité dans CF et sous-champs de la non-CF, contrastant avec une variabilité importante dans le confiance du traçage19.
Variabilité intrinsèque par rapport aux seuils significatifs
C’est très important, la variabilité physiologique de la mesure est considérable, comme illustré dans les différentes études10, tels que les essais de thérapie de gène CFTR dont fait preuve d’une grande variabilité dans les changements dans le transport total de chlorure et l’amiloride rang21,22. Evaluation transversale suggère que zéro Cl– plus l’isoprotérénol réponse au-dessus du seuil de -5 à -7 mV est la coupure entre les FC et les sujets non-CF10.
Néanmoins, il nous manque clairement connaître l’ampleur du changement de ce paramètre, ce qui représente une correction efficace du CFTR dans les essais de phase II avec immunomodulateurs. Pour évaluer la réponse individuelle, il faudra des essais répétés, surveillance de la réponse à une intervention de distinguer les changements significatifs de variabilité intrinsèque. C’est très important, futures études à long terme avec maladie médicaments devront démontrer qu’amélioration de la fonction CFTR est corrélée avec l’amélioration des résultats cliniques pertinents ou résultats de substitution (par exemple les amélioration FEV1) FC maladie. En effet, une récente phase II Ivacaftor étude démontre marqué bénéfice clinique malgré une légère amélioration dans la sécrétion de chlorure23.
Ces études contribueront à établir si une valeur limite de l’amélioration de la conductance Cl–trans-épithéliales pourrait être un paramètre de substitution de bénéfice clinique. C’est un paramètre important pour orienter l’évolution de la CFTR modifiant les thérapies.
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes : Sweat Test et mesures actuelles intestinale (ICM)
Chez les patients atteints de mucoviscidose ” discutable ”, comme évaluée par une sueur intermédiaire Cl– concentration entre 30 et 60 mM, scores composites NPD a fourni un outil hautement sensible pour diagnostiquer les patients comme ” CF-probable ” et ” CF-improbable ”10 . Intestinale mesure du courant (ICM), qui fournit une mesure ex vivo du net Cl– flux à travers l’épithélium rectal, autorise également détermination de la fonction résiduelle du CFTR avec une sensibilité élevée car le CFTR est fortement exprimée dans Cet épithélium.
Étant donné la modification de la fonction CFTR de modulateurs CFTR, la relation entre ces différents changements de biomarqueurs CFTR est actuellement incertaine. Bien qu’issu des travaux récents Ivacaftor déterminé que test NPD et la sueur sont corrélés4, il n’a pas encore été établi si une mesure dans les voies respiratoires est un meilleur indicateur de résultat respiratoire que, par exemple, test de la sueur24 , 25 ou changement dans ICM. En outre, médicaments modificateur peuvent également différer dans leur efficacité spécifiques d’organe. En ce qui concerne le NPD, il est important de noter que les changements en réponse basale de PD et amiloride expriment transport Na+ , tandis que les changements dans 0 Cl– et l’isoprotérénol réponse expriment transport Cl– . C’est encore à établir lequel de ces est plus important pour l’amélioration de la maladie.
Application future de cette Technique
L’utilisation de cette technique est prévue en dehors du champ de CP. Étant donné que cette technique est particulièrement adaptée pour illustrer Na+ et Cl– canal d’ion, il peut être appliqué pour montrer un dysfonctionnement dans les maladies de voies respiratoires dont l’asthme26,27de bronchite chronique, non-CF bronchectasie28 et29de la pancréatite récidivante. En outre, les modifications de cette technique ont été utilisées dans les voies respiratoires inférieures (LAPD) démontrer axés sur les voies respiratoires inférieure dysfonction de la CFTR chez les patients de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) avec la bronchite chronique30.
NPD fournit un biomarqueur sensibles en vivo de fonction CFTR, qui peut être utilisé pour les deux le diagnostic et, également, pour les études de validation visant à corriger le CFTR et ENaC canaliser l’activité dans la recherche translationnelle. Cela permet une évaluation longitudinale de fonction trans épithélial et prometteur comme une stratégie pour la médecine personnalisée adapter le correcteur plus efficace pour chaque patient fibro-kystiques.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le groupe de travail pour la fonction CFTR de la Commission de normalisation (réseau d’essais cliniques, European Cystic Fibrosis Society) et ressources Centre de groupe de travail National (réseau de développement de produits thérapeutiques, la fibrose kystique Fondation). Un soutien supplémentaire a été fourni par la Fondation de CF (Clancy FY09 à GMS) et le NIH (DK072482 SMR et GMS).
Materials
| KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) | Fisher Scientific | ||
| Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
| BMA-200 AC/DC portable bioamplifier | AD Instruments | ||
| IS0-Z isolation headstage for BMA-200 | AD Instruments | ||
| Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher | Various | ||
| AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher | AD Instruments | ||
| ECG electrode (ground for study subject) | Hospital standard | ||
| 2 mini calomel reference electrodes | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
| Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm | Spectrum | ||
| Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) | Hospital standard | ||
| 2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
| 2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm | SLE Instruments | ||
| Signacreme® Conductive Electrode Cream | Fisher Scientific | Parker Labs ref # 17-05 | |
| Skin abrasion device | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
| Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs | Ash Instruments | ||
| Becton Dickinson PE 50 tubing | Fisher Scientific | 427411 | |
| Becton Dickinson PE 90 tubing | Fisher Scientific | 427421 | |
| Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
| Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) | 3M | 1530-1 | |
| Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
| 1" X 10 yards silk tape | 3M Durapore | 1538-1 | |
| IV extension tubing (30", 50/box) | International Limited | IMN30 | |
| Three-way stopcock (50/box) | Medex | MX5311L | |
| Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
| Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 427564 | |
| Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 367283 | |
| Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box) | Fisher Scientific | 309653 | |
| Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box | Fisher Scientific | 309604 | |
| Single use sterile wipes (per institutional availability) | Hospital standard | ||
| 70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable) | Fisher Scientific | 430624 | |
| Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) | SureCare | ||
| 23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box) | Becton Dickinson | 367283 | |
| Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery | Fisher Scientific | ||
| Head and chin rest (or equivalent; optional) | Richmond Products, Inc | 629R | |
| Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent) | Fisher Scientific | No. 791 | |
| REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE | |||
| Sodium Chloride, Granular – USP NaCl | Spectrum | Formula Weight: 58; Size: 500 gm | |
| Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 147; Size: 500 gm | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
| Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP | Spectrum | Formula Weight: 174; Size: 500 gm | |
| Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) | Spectrum | Formula Weight: 136; Size: 500 gm | |
| Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 218; Size: 500 gm | |
| Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) | Spectrum | Formula Weight: 430; Size: 500 gm | |
| Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) | Spectrum | Formula Weight: 234; Size: 500 gm | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O | Spectrum | Formula Weight: 246; Size: 500 gm | |
| Amiloride HCl – USP | Spectrum | Formula Weight: 302; Size: 5gm | |
| Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 551; Size: 5gm | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
| Double-distilled water (ddH2O) | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 1 L | |
| Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule | Hospital Pharmacy | Formula Weight: 248; Size: single use | |
| Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 5 L |
Referências
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