Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

George M. Solomon; Inez Bronsveld; Kathryn Hayes; Michael Wilschanski; Paola Melotti; Steven M. Rowe; Isabelle Sermet-Gaudelus

doi:10.3791/57006

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Medicina

Medición estandarizada de la diferencia de potencial transepitelial Nasal membrana (NPD)

Published: September 13, 2018

doi:

10.3791/57006

George M. Solomon¹, Inez Bronsveld², Kathryn Hayes³, Michael Wilschanski⁴, Paola Melotti⁵, Steven M. Rowe¹, Isabelle Sermet-Gaudelus^6,7

¹Department of Medicine and the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center,University of Alabama at Birmingham, ²Department of Pulmonology and Tuberculosis,University Medical Center Utrecht, ³Center for Experimental Medicine,Queens University, Northern Ireland, ⁴Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, ⁵Centro Fibrosi Cistica,Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata, ⁶Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques and Center de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose,Hôpital Necker Enfants Malades, ⁷INSERM U 1151,Institut Necker Enfants Malades

Summary

Aquí, presentamos un protocolo estandarizado para medir la diferencia de potencial nasal (NPD). Regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y función epitelial del sodio (ENaC) son evaluados por el cambio en el voltaje a través del epitelio nasal después de la superfusion de soluciones que modifican la actividad del canal del ion, proporcionando un medida de resultado.

Abstract

Describimos a una medición estandarizada de la diferencia de potencial nasal (NPD). En esta técnica, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y el sodio epitelial (ENaC) función son monitoreados por el cambio en el voltaje a través del epitelio nasal después de la superfusion de soluciones que modifican el canal iónico actividad. Esta opción está activada por la medida de la diferencia de potencial entre el compartimento subcutáneo y el epitelio de las vías respiratorias en la fosa nasal, utilizando un catéter en contacto con el cornete nasal inferior.

La prueba permite la medición de la tensión de referencia estable y los cambios de tensión de red sucesivos después de la perfusión de 100 μm amilorida, un inhibidor de la reabsorción de Na⁺en solución de Ringer; una solución libre de cloro que contiene amilorida a la secreción de cloruro en coche y 10 μm isoproterenol en una solución libre de cloro con amiloride para estimular el monofosfato de adenosina cíclico (campo)-conductancia de cloruro dependientes relacionadas con CFTR.

Esta técnica tiene la ventaja de demostrar las propiedades electrofisiológicas de dos componentes clave establecer la hidratación del líquido superficial de las vías respiratorias del epitelio respiratorio, ENaC y CFTR. Por lo tanto, es una herramienta de investigación útil para la fase 2 y la prueba de pruebas de concepto de agentes que atacan la actividad CFTR y ENaC para el tratamiento de la enfermedad pulmonar de la fibrosis quística (FQ). También es un proceso clave de seguimiento para establecer la disfunción CFTR cuando las pruebas genéticas y la prueba de sudor son ambiguos. A diferencia del cloruro del sudor, la prueba es relativamente más lento y costoso. También requiere operador de entrenamiento y conocimientos para llevar a cabo la prueba con eficacia. Variabilidad inter y intra subject se ha divulgado en esta técnica especialmente en sujetos jóvenes o. Para ayudar con esta preocupación, interpretación ha sido mejorada a través de un algoritmo recientemente validado.

Introduction

El objetivo general de este método es medir la diferencia de potencial nasal (NPD) que se pretende investigar transporte trans epitelial ion en vivo¹. Esta técnica permite la medición del sodio (Na⁺) y el transporte de cloruro (Cl^–). NPD se ha utilizado como herramienta de investigación desde la década de 1980 y fue aceptada en 1998 como un procedimiento de diagnóstico por la Fundación de la Fibrosis Quística (CFF) consenso declaración² y en el año 2017 en las directrices de diagnóstico de consenso de la Fundación de la Fibrosis Quística (CFF) ³. de hecho, biológica disfunción CFTR, que es la causa de la FQ, es evidenciada por una mayor absorción de Na⁺en la membrana apical y un defecto en la secreción de Cl^– . Esta prueba funcional proporciona la ventaja de una herramienta de diagnóstico adicional cuando la genética es no concluyente en pacientes con prueba de sudor intermedios indeterminados resultados³. Aunque esta información también puede obtenerse biopsias intestinales de medición actual (ICM), ICM, sin embargo, es sólo disponible en algunos centros a nivel mundial y las necesidades más estandarización. NPD está más disponible en aproximadamente 60 centros mundiales y, además, objetivos del epitelio respiratorio que es el lugar principal de la enfermedad.

Dada la información que ofrece sobre la actividad CFTR, se utiliza también en estudios de prueba de concepto con el objetivo de evaluar la restauración funcional de la proteína CFTR por modulador terapias⁴^,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸. De hecho, datos de estudios con edición de ARNm del gen CFTR, potenciador CFTR y terapias de corrector, ponen de relieve cambios significativos en Cl^– y Na⁺ de transporte con terapia⁶^,⁹ y confirma que el NPD puede ser un extremo sensible en los ensayos clínicos. Como carecemos de puntos finales clínicos sensibles capaces de detectar un cambio sutil en el estado clínico del paciente en el corto plazo, este biomarcador preclínica puede ser muy informativo. El campo de las terapias de modulador CFTR se amplía rápidamente y necesitamos con urgencia pruebas en vivo que son capaces de descifrar rápidamente compuestos activos antes de ir a grande fase 3 ensayos¹⁰.

El fundamento fisiológico de la técnica se basa en la medición de la diferencia de potencial entre el epitelio de las vías respiratorias en la fosa nasal y el compartimento subcutáneo. Actividades de canal de iones se exploran midiendo la diferencia de potencial de referencia máxima estable (PD), sus cambios tras bloqueo de ENaC relacionada con la absorción de Na⁺ y conducción de la secreción de Cl^– mediante diferentes transportadores apicales de Cl^– incluyendo el CFTR. Disfunción CFTR se muestra por un cambio mínimo en la diferencia de potencial sobre el estímulo de la secreción de Cl^– a través de una vía dependiente de cAMP y un mayor ENaC mediada por absorción Na⁺ detecta una diferencia de potencial más negativa de línea de base y una respuesta mejorada a amilorida. La base mecanicista de CF versus PD normal se resume en la figura 1.

Figura 1: figura Resumen de actividad de canal del Ion. Ion (A) actividad en el epitelio respiratorio demostrando equilibrio actividad de ENaC y CFTR en sujetos normales y (B) pérdida de la actividad CFTR que aumentó el transporte de sodio ENaC mediada y redujo cloruro dependiente de CFTR transporte. ENaC: canal epitelial del sodio, Na⁺: sodio, CFTR: regulador transmembrana de la fibrosis quística, CL^–: cloruro, mV: milivoltios, PD: diferencia de potencial, min: minutos/s haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sin embargo, esta prueba demuestra cierto grado de variabilidad en mediciones repetidas en el mismo paciente y entre pacientes con el mismo genotipo. Esto es de suma importancia para facilitar la interpretación de los cambios después del tratamiento modulador. Por otra parte, todavía no tenemos umbrales validados discriminar entre CF y sujetos sanos. Esto puede ser parcialmente debido a las diferencias entre la disponibilidad de servicios clínicos y las técnicas empleadas. Por lo tanto, un considerable esfuerzo internacional dirigido a la normalización de la prueba está en curso. El nos CFF-TDN (red de desarrollo de terapéutica de la Fundación de Fibrosis quística) y el CTN ECFS (Red Europea de ensayos clínicos de la sociedad de Fibrosis quística) crean un NPD procedimiento operativo estándar (SOP) para el uso en los ensayos del multicentro y la investigación. Este reciente trabajo colaborativo por el CTN y TDN ha dado lugar a una concesión internacional, combinada, que reúne la experiencia de la CTN y TDN (2014)¹¹. Este documento presenta las técnicas de protocolo y prueba para emplear NPD para el diagnóstico de CF o para ensayos de prueba de concepto Iniciado por el investigador. Cada centro de aplicación de la técnica es responsable de la solicitud a su Comité de ética de investigación institucionales para su aprobación.

Figura 2: esquema de todo recomienda configuración NPD. Observe que se muestra la configuración recomendada, incluyendo bombas de perfusión secuencial y la configuración de serie de 4 llave. Conexiones específicas y algunos ejemplos de componentes se muestran en el SOP. (Diagrama modificado con permiso de Solomon, G.M. pecho, 2010-¹³) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El flujo experimental general se describe en la figura 2, por el que NPD se mide entre el puente explorando colocado en el puente de referencia y la superficie de epitelio en el espacio subcutáneo, ambos conectados a electrodos y una alta impedancia voltímetro.

Esto es asegurado por 2 sistemas diferentes: hay 2 configuraciones de electrodo de referencia aceptable: () electrodos de Ag/AgCl y un puente lleno de crema de Electrocardiograma (ECG) conectado al espacio subcutáneo por la abrasión ligera o (ii) saturado calomel Half-cells y un agar lleno de agujas de calibre 22 a 24 introducido por vía subcutánea. El contacto con la mucosa nasal está habilitado por un catéter de doble luz. Un lumen es rellenas de agar o crema de ECG conectado al electrodo de medida y el otro permite la perfusión en la mucosa nasal de las diferentes soluciones.

La punta de la tubería de explorar se coloca sobre la mucosa respiratoria bajo la inferior nasal cornete nasal (figura 3).

Figura 3: colocación de tubería en la mucosa respiratoria de explorar. (A) vista externa que muestra la colocación. (B) vista Rhinoscopic demostración de colocación. (C) diagrama que indica la localización anatómica de la colocación del catéter. PD: diferencia de potencial

Para estudiar la respuesta de PD a varias drogas, se aplican las soluciones superfusion vía el segundo lumen del catéter. Hay varios pasos claves con respecto a la preparación y realización de las mediciones de la NPD, que a continuación se detallan en el protocolo de preparación inicial a través de análisis de datos.

Después de la preparación de soluciones y electrodos, prueba de la calidad adecuada de los catéteres y electrodos permite la conducta básica de la prueba. Basal se realizan a lo largo del cornete nasal, inferior que permite la selección de los mejores lugares para la medición, generalmente que la valoración más negativa. Perfusiones secuenciales determinan Na⁺ (ENaC) y Cl^– flujo de iones (dependiente de CFTR) vía un cambio en el voltaje a través del epitelio nasal.

Protocol

El protocolo con sujetos humanos fue aprobado por el Comité de investigación de todos los institutos participantes. Cada centro de aplicación de la técnica es responsable de la solicitud a su Comité de ética de investigación institucionales para su aprobación. 1. preparación de la solución Preparar soluciones #1, #2 y #3, que son soluciones de base, en lotes de 1 L antes del procedimiento y almacenados en el sitio (cuadro 1).Nota: Amilorida es sensible a la luz y deben almacenarse en la oscuridad (ver tabla 1 para la composición de la solución) (véase SOP para solución detallada preparación11). Todas las soluciones a pH 7.4 y filtro con filtro 0,22 μm superior de la botella del almacenador intermediario. Solución #3, añadir las sales que contiene el fosfato primero, deje que ionizan para evitar cristalización (ver tabla 2 para la composición de la solución).Nota: La secuencia de la mezcla es crítica para la solución #3. Almacenar estas soluciones a 4 ° C (estable por 3 meses) o a-20 ° C (estable durante 6 meses). Preparar soluciones #4 y #5 mediante la adición de agentes el día de la prueba NPD. Isoproterenol es luz y oxidación sensible y pierde su actividad a temperatura ambiente (demostrando la decadencia del 4% durante 4 h a 4 – 8 ° C). Almacenar a 4 ° C.Nota: El ATP es la luz y la oxidación sensible (ver tabla 3). Compuesto Peso molecular Concentración (mM) Composición (g/L) NaCl 58 148 8.58 CaCl2 2 H2O 147 2.25 0.33 KCl 75 4.05 0.3 K2HPO4 174 2.4 0.42 KH2 PO4 136 0.4 0.05 MgCl2 6 H2O 203 1.2 0.24 Tabla 1: Composición de la solución. Compuesto Peso molecular Concentración (mM) Composición (g/L) Gluconato na 218 148 33,26 Gluconato de CA 430 2.25 0.97 Gluconato de K 234 4.05 0.95 K2 HPO4 174 2.4 0.42 KH2 PO4 136 0.4 0.05 MgSO4 7 H2O 246 1.2 0.24 Tabla 2: Composición de la solución. Solución Solución número Contenido Marca EDC Inyección de timbres Solución #1/A Con timbres para inyección TIMBRES Timbres + amilorida Solución #2/B Timbres con + 100 μM amilorida AMIL Cero Cl– + amilorida Solución #3/C Tamponada con cero Cl– + 100 μM amilorida OCL Cero Cl– + amilorida + isoproterenol Solución #4/D Tamponada con cero Cl– + 100 μM amilorida + 10 μM isoproterenol ISO Cero Cl–+ amilorida + isoproterenol + ATP Solución #5/E Tamponada con cero Cl– + 10 μM isoproterenol + 100 amilorida μM, 100 μM ATP ATP Tabla 3: Lista de solución. 2. catéter Utilice un PVC, estéril, no reutilizable, catéter 2 lúmenes (Ø 0.7 mm interior) con una extremidad redonda y lisa (2.5 mm exterior Ø), que está diseñada específicamente para el NPD. Hacer contacto con la mucosa por un orificio lateral, distante a la punta con un orificio en la punta para perfusión 2 mm (ver paso 10.1). Conecte una de las dos conexiones Luer-lock del catéter para el electrodo de medición y la otra a la bomba de perfusión. Usar el canal teñido en azul como la luz de la medición. El catéter de la etiqueta en cada intervalo de 0,5 cm por 10 cm.Nota: El espacio muerto es de 0,3 mL. Es preferible usar el procedimiento anterior para la preparación del catéter, si esto no es posible seguir los dos pasos siguientes. Corte longitudes iguales (~ 76 cm) de tubo de catéter PE50 y PE90. Pegue estos juntos en una pieza de 1 cm de tubo de goma de silicona. Inserte una ceñida de aguja de punta Roma de 25 G en el extremo opuesto de la tubería de PE-90. Inserte una ceñida de aguja mariposa 25 G en el extremo opuesto del tubo PE50 asegurándose de no pinchar el tubo como se coloque. Figura 4: catéter utilizado para la medición de la NPD. Cuadro bajorrelieve muestra la punta del catéter con orificio de medición. 3. preparación de Agar piel puente (aguja de la mariposa) y el catéter Nota: La manipulación del agar fundido puede causar quemaduras, y esto debe hacerse con precaución. Para preparar agar al 3%, mezclar 3 g de agar con 100 mL de solución #1 en un frasco de boca ancha. Fundir el agar en el microondas hasta que soluble (transparente). Llene la jeringa de 10 mL con agar caliente. Conecte la jeringa posteriormente la aguja de la mariposa (23 G) y la marcada luz del catéter. Inyectar el agar hasta que aparezca en la punta. Deje que se enfríe durante al menos 10 minutos. Asegúrese de que el puente de la piel y la sonda completamente llenados y visualizados para estar libre de burbujas de aire. Almacenar los puentes de piel a granel en la solución #1 a 4 ° C y no lo use después de 1 semana. 4. Si crema con ECG Diluir la crema de ECG con solución #1 (1:1, v/v timbre). Deja reposar hasta que quede libre de burbujas de aire. Llene la jeringa de 10 mL con crema diluido de ECG. Conectar la jeringa al marcada lumen del catéter e inyecte lentamente la crema de ECG hasta que aparece en el orificio inferior del lado. Asegúrese de que el catéter esté completamente llena y sin burbujas de aire. 5. sistema de adquisición de datos Nota: La configuración general del sistema de adquisición de datos se muestra en la figura 5. Figura 5: puesta en marcha de sistema de adquisición de datos. Demostrando las conexiones de los bioamplifier y headstage a la interfaz de la computadora, así como las conexiones del electrodo a la headstage11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Conexiones de Conecte el equipo al sistema de adquisición de datos (Tabla de materiales) con un cable USB. Para conectar el sistema de adquisición de datos a la bioamplifier, conecte el cable BNC desde el canal 1 de entrada en el sistema de adquisición de datos (frente) a la salida de la bioamplifier (parte posterior). Conecte el bioamplifier a la headstage con un cable de encargo previamente conectado a los tornillos de headstage en el parte de entrada en el frente de la bioamplifier. Conecte el headstage a los electrodos y el electrodo de tierra. Utilice el estándar de 2 mm hembra-hembra conectores para conectar la parte delantera del headstage a los electrodos.Nota: El puerto es empotrado y sólo cabe una dirección del cable de 2 mm: electrodo medición de rojo para la nariz de la paciente (a través de catéter nasal); Electrodo de referencia de negro de puente de piel del paciente; Blanco electrodo de ECG conectado a tierra a la piel del sujeto. Fije el bioamplifier como se describe: Offset: pull para activar, a su vez a ajustar, deje tirado después de ajuste; Voltaje: DC; 1 mV cal: posición neutra; Energía: En para recolectar datos, apagado para cargar la batería; Ganancia: valor 10; Pase de banda: LoFreq (control externo): DC; Pase de banda: HighFreq (control interno): 1kHz; Volumen: apagado. 6. Ajuste el desplazamiento de la cabeza-etapa Conecte la computadora portátil y el amplificador en la secuencia como se indica en el SOP11. Encienda el sistema de adquisición de datos y luego el portátil (la secuencia es importante para el software reconocer el aparato utilizado para la adquisición de datos). Ajustar el Offset etapa según la secuencia de SOP. 7. compensaciones Nota: Hay varios desvíos a probarse para asegurar la estabilidad del sistema eléctrico de medición. (ver figura 6) El desplazamiento del electrodo, Junte el electrodo de referencia (negativo) y medición electrodo (positivo) en la crema diluida de ECG o el 3 M KCl. Asegúrese de que la diferencia de potencial entre los electrodos de lectura está cerca de cero en el headstage. Para ajustar el desplazamiento de puente de catéter o de la piel, coloque el extremo Luer-lock del catéter nasal o al final de la Luer-cerradura del puente de piel en el baño con el electrodo de medición (positivo). Coloque el otro extremo del catéter en el baño de crema de ECG o 3 M KCL que contiene la referencia de electrodo (negativo) asegurando que la diferencia de potencial es cercano a cero en el headstage. Para configurar un desvío de lazo cerrado, asegúrese de que el circuito esta cerrado cuando vuelva a colocar el catéter nasal en el baño de los electrodos. Compruebe que el lazo cerrado compensado Lee cerca de 0 mV (= ‘offset’; ±2. 5 mV). Ajuste la perilla de compensación de headstage para traer el offset a 0 mV.Nota: Esto confirma que todas las conexiones dentro del circuito están intactas. Si este no es el caso, el catéter nasal puede no ser intacto (burbujas en el agar o la crema de ECG). Cambiar el puente de agar o empujar la crema de ECG en la configuración. El desplazamiento del electrodo se debe realizar en primer lugar, seguido por el cerrado sistema (lazo cerrado compensado) con el electrodo y el puente (figura 6). Figura 6: Configuración de desplazamiento del electrodo, (B) catéter (A) (o puente), offset offset de lazo cerrado (C). 8. la jeringa puesta a punto Nota: La siguiente es la configuración recomendada. Descongelar las soluciones #1, #2 y #3 aproximadamente 1 h antes de la medición. Conecte la línea de extensión a la llave de paso más cercana al catéter. Encienda todas las bombas y lave el catéter con solución #1 para eliminar completamente apagado el catéter hasta llaves de paso de burbujas. 9. colocación de la referencia y el electrodo de medición Figura 7: Tema con electrodo y subcutáneo puente para medidas de medición. Tienen el objeto de estudio toma una posición sentada frente al operador NPD. Para mayor comodidad, coloque los pies en la estera antiestática opcional y la cabeza sobre el resto de barbilla de ortóptica. Conectar el electrodo de plomo de la tierra a la almohadilla de ECG colocada en el brazo del sujeto (figura 7). Inserte la aguja subcutánea en antebrazo dorsal (sistema de agar) o el electrodo de referencia se aplica a la crema de ECG en un área previamente mínimamente erosionado en el antebrazo (ver puntos 7 a 10 a continuación). Compruebe la conexión al espacio subcutáneo midiendo la diferencia de potencial con la piel (dedo PD) y pidiendo el tema para cerrar el “orificio de medición” pellizcando el catéter entre la punta de sus dedos pulgar e índice. Si la PD del dedo no es de -30 mV o más negativo, comprobar la inserción de la aguja de la mariposa. Repita la abrasión (para montaje de ECG crema) y compruebe puentes. Arranque la bomba de jeringa de solución #1 a 80 mL/h. comienzo con la fosa nasal derecha. Medir el dedo PD como una tensión negativa constante (típico rango -40 a -80 mV). Si usas el sistema de la crema de ECG: diluir la crema de ECG 1:1 y llene el catéter después de una descarga completa fuera del orificio de sonda como ya visto para el Agar. Conectar el catéter a una jeringa de 50 mL lleno la mitad con la crema de ECG para bañar los electrodos, permitiendo la verificación de la compensación del electrodo y el puente de conjunto. Conectar la referencia Ag/Cl electrodo en el espacio subcutáneo por abrasión mínima anterior leve de la piel, la piel aparecerá ‘rosa y brillante’ cuando se alcanza el nivel de la dermis. Coloque el electrodo de medición, cubierto con crema de ECG, en la piel erosionada. Compruebe el dedo PD como se ha demostrado para el sistema de Agar. 10. medición de la Basal EP Inserte el catéter nasal en la fosa nasal derecha con una rhinoscope reflectante (o equivalente) para visualizar al cornete nasal inferior. Con la punta anterior como un punto de referencia, haga avanzar el catéter dirigido al sitio inferior del inferior cornete en la mucosa respiratoria. Por otra parte, si la colocación es difícil, se puede colocar el agujero de la sonda en contacto con el suelo de la fosa nasal.Nota: El catéter es lo suficientemente rígido para guiarse en la fosa nasal por el operador. Para facilitar la colocación, un canal del catéter es de color azul y contiene el agujero de sonda lateral en contacto con el cornete nasal inferior. Esto impide la rotación del catéter. Las marcas indicadas en el catéter de 1 a 10 cm de proporcionan puntos de referencia fácil. Medida de la PD en el cornete nasal inferior. Para ello, compruebe que el orificio de medición del catéter esté cerrado por su posicionamiento contra la mucosa del cornete inferior (marca básica en el derecho). Medir la PD 3.0, 2.0, 1.5, 1.0 y 0.5 cm (distancia dentro del meatus inferior desde el cornete nasal inferior): marca de PDs Basal derecho. Mantener cada medida en la distancia especificada durante aproximadamente 5 s cada para garantizar una lectura constante (± 1 mV) y para facilitar la interpretación de los valores basales de PD. Repita los pasos anteriores en la fosa nasal izquierda, usando la tecla de función para marcar la PDs Basal izquierda (3 cm, 2 cm, etc.) y la izquierda Basal en. Con las medidas basales de PD como guía, inserte la sonda del catéter nasal para el sitio de señal más negativa (hasta 3 cm de la extremidad anterior del cornete nasal inferior) y seguro con un pequeño trozo de cinta en la punta de la nariz (o equivalente). 11. rastreo de perfusiones secuenciales de NPD Para la fosa nasal derecha Verificar que la solución está goteando de la nariz del paciente. Tiene el sujeto asume una posición cómoda con la cabeza hacia abajo (a menudo ayudado por tener el tema descansar su cabeza en la mano o utilizar una mentonera u otro dispositivo de inmovilización). Recordar el tema para minimizar el movimiento y evitar tocar la nariz o la tubería y evitar hablar. Gire a la solución #1 bomba (timbres) (5 mL/min o 300 mL/h). Grabar hasta obtener un valor estable (< 1 mV cambio/30 s).Nota: Esto toma aproximadamente 3 minutos para conseguir la estabilidad. Apague la perfusión con solución #1. Iniciar la perfusión con solución #2 (amilorida). Registre el NPD para un mínimo de 3 minutos (si el voltaje de la meseta está en duda, continuar la grabación de hasta 5 min total). Iniciar la perfusión con solución #3 (cloruro de cero). Registre el NPD para un mínimo de 3 minutos (si el voltaje de la meseta no es estable, continuar la grabación de hasta 5 min total). Iniciar la perfusión con solución #4 (Isoproterenol). Registre el NPD para un mínimo de 3 minutos [si el voltaje de la meseta no es estable (un trazo de voltaje constante durante al menos 30 s de < 1 mV deriva), continuar con la grabación de hasta 5 min total]. Iniciar la perfusión con solución #5 (ATP). NPD registro por un mínimo de 1 minuto, hasta obtener un pico hiperpolarizantes respuesta. Encienda la perfusión con la solución #1 (timbres) y 30 s para lavar el catéter. Apague la perfusión de la solución #1. Repita el procedimiento para la fosa nasal izquierda. 12. final de la prueba Vuelva a verificar y registrar PD estable del dedo “(dedo del Post del) para 5 s. Quitar el puente cutáneo del sujeto y el vendaje desde el sitio de inserción en la piel. Para el sistema de la crema de AgCl/ECG, retire el electrodo del brazo. Registrar la tensión de “Offset Final lazo cerrado” como se ha descrito para medir el desplazamiento inicial cerrado (ver paso 7.1.3). Desplazamiento final de la marca con la tecla de función. Dejar de adquisición de datos (pulse “Start”).Nota: La compensación actual recomienda el uso de 100 μm ATP para activar el purinérgicos calcio dependiente Cl– la secreción, para servir como un control positivo para la prueba; sin embargo, esto es una prueba opcional.

Representative Results

En epitelios de las vías respiratorias normales, la absorción de Na+ es la actividad de transporte de iones primarios. Esto resulta en una diferencia de potencial superficial negativa de la vía aérea en relación con el intersticio. Perfusión de la amilorida de bloqueador de canal de ENaC conduce a una diferencia de potencial menos negativa. Entonces, la superfusion de Cl–-solución libre crea un gradiente químico para Cl-, que crea una diferencia de potencial más negativa y activa todos los transportadores de Cl– , incluyendo CFTR. Isoproterenol, que aumenta el cAMP intracelular, más aumenta la secreción de Cl– activando específicamente CFTR y la diferencia de potencial. Por el contrario, en los temas de la CF, ausente o disfuncional CFTR resultados en un mayor ENaC mediada por Na+ absorción12. Como resultado, la diferencia de potencial de referencia es más negativa. La despolarización observada con el uso de amilorida es mayor, considerando que existe un mínimo o ningún cambio en la diferencia de potencial sobre el estímulo de la secreción de Cl– a través de CFTR dependiente. Esto puede verse en los trazos representativos en la figura 8, muestra vs ‘sanas’ trazos ‘CF’. Figura 8: trazos representativos del tema ‘saludable’ y el tema con CF. PD: diferencia de potencial, ΔAmiloride: delta amilorida/ISO de 0 Cl––: baja de cloruro: el cambio en la EP entre la finalización de la solución #2 y la perfusión de solución #4, S1-S4: etapas 1-4, verde línea en gráficos A y B indican el trazado de NPD y negro las flechas indican la diferencia en la diferencia de potencial

Discussion

In vivo, NPD proporciona una medida única que se puede realizar repetidamente en forma longitudinal y demuestra que con medidas repetidas, se observan similares resultados longitudinales sobre una base individual y grupo¹⁴^, ¹⁵. Hay fuerte evidencia que el NPD tiene validez excelente discriminación para distinguir CF de los CF no. 25 estudios consistentemente demostraron una diferencia estadísticamente significativa en Cl^– y la conductancia de Na⁺ entre los pacientes con FQ y controles sanos¹⁰. Mientras que varios índices desarrollados previamente demuestran esta capacidad, esperamos que las nuevas versiones son necesarios dada la reciente normalización de metodología⁷^,⁸.

Modificaciones y la resolución de problemas

Esta prueba requiere de varios pasos claves para asegurar medidas precisas. Esto incluye el desplazamiento de bucle cerrado de catéteres y electrodos para asegurar que el sistema esté funcionando a estándares recomendados. Pacientes deben permanecer inmóvil y abstenerse de hablar que esto minimiza los artefactos y desplazamiento del catéter. Esto hace que la prueba sea difícil en pacientes no cooperativos y la técnica se ha divulgado solamente en un estudio en niños menores de 6 años de edad⁷.

La inspección previa del epitelio nasal es necesaria para asegurar que no hay costras ni mucosidad en el epitelio, que puede afectar las mediciones.

Muy importante, se debe señalar que la ubicación de la colocación del catéter es objeto de debate. El SOP presentado aquí utiliza medida bajo el cornete nasal inferior (es). La colocación del catéter debajo de la que ha sido estandarizada y llevó a cabo en estudios clínicos multicéntricos y, por lo tanto, esta es la técnica recomendada. Medida de debajo de la que se realiza con el catéter de agujero lateral, que puede ser difícil de mantener en firme contacto con la mucosa nasal, estando en contacto con las soluciones. Otros grupos pueden medir el PD en el piso nasal, que es técnicamente más fácil. Lo importante, Vermeulen (2011) demostró que los 2 métodos son comparables¹⁶.

El calentamiento de las soluciones, sigue siendo un tema de debate entre europeos y centros de Estados Unidos¹⁷^,¹⁸. Se ha abogado que mediante soluciones a 37 ° C en lugar de 22 ° C aumenta la respuesta de cloruro total observado por aproximadamente 25% y la respuesta de cloruro dependientes de isoproterenol por aproximadamente 95%¹⁸. Sin embargo, el calentamiento aumenta la variabilidad, según lo determinado por una mayor desviación estándar de la respuesta de cloruro total¹⁷. Por lo tanto, como el calentamiento de las soluciones es un factor adicional de variabilidad, se recomienda no calentar las soluciones a menos que se requiere en una base de estudio.

Anteriormente hemos comparado tanto de las técnicas de electrodo y encontrado que sistemas de electrodo de calomelanos y AgCl funcionan semejantemente en corrientes basals y estimuladas en sujetos normales¹³.

Limitaciones de la técnica

Esta prueba está sujeta a variabilidad significativa del sujeto. La variabilidad de puntuación es especialmente frecuente en pacientes con trazos indeterminados y esto debe explicarse en aplicación de diagnóstico¹⁹. Factores de variabilidad incluyen infección aguda del tracto respiratorio superior, amplia pólipos nasales, cirugía previa de los senos e inflamación relacionados con la CF, que disminuye su especificidad y sensibilidad²⁰^,¹⁰. Además, interpretación de trazados puede ser diferente entre los lectores, aunque los lectores expertos demuestran el excelente acuerdo de puntuación cuantitativa y la interpretabilidad en CF y CF no trazados, contrastando con una importante variabilidad en la confianza del seguimiento¹⁹.

Variabilidad intrínseca versus umbrales significativos

Muy importante, la variabilidad fisiológica de la medición es considerable, como se ilustra en diversos estudios¹⁰, tales como los ensayos de terapia de gen CFTR que demostraron una variabilidad considerable en los cambios en el transporte total de cloruro y amilorida gama²¹^,²². Evaluación transversal sugiere que cero Cl^– más respuesta de isoproterenol por encima del umbral de -5 a -7 mV es la desconexión entre CF y CF no temas¹⁰.

Sin embargo carecemos de un conocimiento claro sobre la magnitud del cambio de este parámetro que representa una eficaz corrección de CFTR en ensayos de fase II con terapias de la enfermedad. Evaluar la respuesta individual, pueden requerirse repetidas pruebas de monitoreo de la respuesta a una intervención para distinguir cambios significativos de variabilidad intrínseca. Muy importante, futuros estudios a largo plazo con medicamentos de la enfermedad tienen que demostrar que mejora en la función CFTR se correlaciona con la mejora en los resultados clínicamente relevantes o sustituto (como la mejoría en el FEV₁) de la FQ de la enfermedad. De hecho, una reciente fase II Ivacaftor estudio demostró marcado beneficio clínico a pesar de una pequeña mejora en la secreción de cloruro²³.

Dichos estudios ayudarán a establecer si un valor de corte de la mejora en la conductancia de Cl^–trans epitelial puede ser un parámetro sustituto para beneficio clínico. Este es un parámetro importante para orientar el desarrollo de terapias de modificación de la CFTR.

Importancia con respecto a los métodos existentes: Test del sudor y las mediciones actuales Intestinal (ICM)

En pacientes con fibrosis quística ” cuestionable ”, como determinado por un sudor intermedio concentración Cl^– entre 30 y 60 mM, NPD compuestos partituras proporcionadas una herramienta altamente sensible para diagnosticar a pacientes ” CF-posible ” y ” CF-improbable ”¹⁰. Medición de corriente intestinal (ICM), que proporciona una medida ex vivo de la red Cl^– flujos a través del epitelio rectal, también permite determinación de función CFTR residual con una alta sensibilidad debido el CFTR se expresa altamente en Este epitelio.

Considerando la modificación de la función CFTR por moduladores CFTR, la relación entre estos diferentes cambios de biomarcadores CFTR es actualmente confuso. Aunque el trabajo reciente basado en Ivacaftor determinado que prueba NPD y el sudor están correlacionadas⁴, todavía no se ha establecido si una medida en las vías respiratorias es un mejor predictor de resultados respiratorios que, por ejemplo, el sudor prueba²⁴ ^, ²⁵ o cambio en ICM. Además, fármacos modificadores también pueden diferir en sus eficacias específicas de órgano. Con respecto a la NPD, es importante tener en cuenta que cambios en la respuesta de PD y amilorida basal expresan transporte Na⁺ , mientras que cambios en Cl 0^– y la respuesta de isoproterenol expresan transporte Cl^– . Aún debe establecerse cuál de ellas es más importante para el mejoramiento de la enfermedad.

Futura aplicación de esta técnica

Se espera que el uso de esta técnica fuera del campo de la CF. Puesto que esta técnica es adecuada únicamente para demostrar Na⁺ y Cl^– canal del ion, puede ser aplicado para demostrar disfunción en enfermedades de las vías respiratorias incluyendo el asma²⁶,²⁷de la bronquitis crónica, bronquiectasia no CF²⁸y pancreatitis recurrente²⁹. Además, las modificaciones de esta técnica se han utilizado en las vías respiratorias inferiores (LAPD) para demostrar disfunción CFTR centrada en las vías respiratorias inferior en los pacientes de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) bronquitis crónica³⁰.

NPD proporciona un biomarcador sensible en vivo de la función CFTR, que puede ser utilizado para el diagnóstico de ambos y, también, para los estudios de prueba de concepto con el objetivo de corregir la CFTR y ENaC canal de actividad en investigación traslacional. Esto permite la evaluación longitudinal de la función trans epitelial y es prometedora como una estrategia de medicina personalizada adaptar el corrector más eficiente para cada paciente con FQ.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por el grupo de trabajo para la función de CFTR de la Comisión de normalización (red de ensayos clínicos, la sociedad europea de Fibrosis quística) y el grupo nacional de recursos centro de trabajo (red de desarrollo de la terapéutica, la Fibrosis quística Fundación). Apoyo adicional fue proporcionado por la Fundación de FQ (Clancy FY09 a GMS) y NIH (DK072482 SMR y GMS).

Materials

KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital)	Fisher Scientific
Powerlab 4/30	AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier	AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200	AD Instruments
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher	Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher	AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject)	Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes	Fisher Scientific	13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm	Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.)	Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode	BIOPAC Systems	UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm	SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream	Fisher Scientific	Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device	PROMED Feeling	Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs	Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing	Fisher Scientific	427411
Becton Dickinson PE 90 tubing	Fisher Scientific	427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD	Fisher Scientific	508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m)	3M	1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US	Marquat	I0202US
1" X 10 yards silk tape	3M Durapore	1538-1
IV extension tubing (30", 50/box)	International Limited	IMN30
Three-way stopcock (50/box)	Medex	MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent)	Fisher Scientific	09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	427564
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	367283
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box)	Fisher Scientific	309653
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box	Fisher Scientific	309604
Single use sterile wipes (per institutional availability)	Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent)	Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable)	Fisher Scientific	430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard)	SureCare
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box)	Becton Dickinson	367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery	Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional)	Richmond Products, Inc	629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent)	Fisher Scientific	No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl	Spectrum		Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP	Spectrum		Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4)	Spectrum		Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder)	Spectrum		Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous)	Spectrum		Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O	Spectrum		Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP	Spectrum		Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 551; Size: 5gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O)	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule	Hospital Pharmacy		Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 5 L

Referências

Rosenstein, B. What is a Cystic Fibrosis Diagnosis?. Clinics in Chest Medicine. 19, 423-441 (1998).
Rosenstein, B., Cutting, G. R. The Diagnosis of Cystic Fibrosis: A Consensus Statement: Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. The Journal of Pediatrics. 132, 589-595 (1998).
Farrell, P. M., et al. Diagnosis of Cystic Fibrosis: Consensus Guidelines from the Cystic Fibrosis Foundation. The Journal of Pediatrics. 181, S4-S15 (2017).
Mesbahi, M., et al. Changes of CFTR functional measurements and clinical improvements in cystic fibrosis patients with non-p.Gly551Asp gating mutations treated with ivacaftor. Journal of Cystic Fibrosis. 16, 45-48 (2017).
Accurso, F., et al. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in Persons with Cystic Fibrosis and the G551D-CFTR Mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
Sermet, I., et al. Measurement of nasal potential difference in young children with an equivocal sweat test following newborn screening for cystic fibrosis. Thorax. 65 (6), 539-544 (2010).
Wilschanski, M., et al. Mutations in the Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene and In vivo Transepithelial Potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787794 (2006).
Sermet-Gaudelus, I., et al. Clinical Phenotype and Genotype of Children with Borderline Sweat Test and Abnormal Nasal Epithelial Chloride Transport. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (7), 929-936 (2010).
De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate endpoint?. European Respiratory Journal. 14, 38 (2013).
US CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutics Development Network) and the ECFS-CTN (European Cystic Fibrosis Society- Clinical Trials Network). Standard Operating Procedure 528.01. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). , (2014).
Knowles, M., et al. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in CF. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1493 (1981).
Solomon, G. M., et al. An international Randomised Multicentre Comparison of NPD Techniques. Chest. 138, 919-928 (2010).
Sermet, I., et al. Chloride Transport in Nasal Ciliated Cells of Cystic Fibrosis Heterozygotes. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171, 1026-1031 (2005).
Naehrlich, L., et al. Nasal potential difference measurements in diagnosis of cystic fibrosis: an international survey. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 24-28 (2014).
Vermeulen, F., et al. Nasal potential measurements on the nasal floor and under the inferior turbinate: Does it matter?. Pediatric Pulmonology. 46 (2), 145-152 (2011).
Bronsveld, I., et al. Influence of perfusate temperature on nasal potential difference. European Respiratory Journal. 42, 389-393 (2013).
Boyle, M., et al. A multi-center study on the effect of solution temperature on nasal potential difference measurements. Chest. 124 (2), 482-489 (2003).
Solomon, G. M., et al. A Multiple Reader Scoring System for Nasal Potential Difference Parameters. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (5), 573-578 (2017).
Beekman, J. M., et al. CFTR functional measurements in human models for diagnosis, prognosis and personalized therapy: Report on the pre-conference meeting to the 11th ECFS Basic Science Conference, Malta, 26-29 March 2014. Journal of Cystic Fibrosis. 13, 363-372 (2014).
Accurso, F., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363, 1991-2003 (2010).
Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38, 59-69 (2011).
Accurso, F., et al. Sweat Chloride as a biomarker of CFTR activity: proof of concept and Ivacaftor clinical trial data. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (2), 139-147 (2014).
Rowe, S., et al. Clinical Mechanism of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator Ivacaftor in G551D-mediated Cystic Fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (2), 175-184 (2014).
Boyle, M., et al. A CFTR corrector lumacaftor and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: a phase 2 randomised controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (7), 527-538 (2014).
Schulz, A., Tummler, B. Non-allergic asthma as a CFTR-related disorder. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (5), 641-644 (2016).
Sloane, P. A., et al. A pharmacologic approach to acquired cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction in smoking related lung disease. PLoS One. 7 (6), e39809 (2012).
Bienvenu, T., et al. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Channel Dysfunction in Non-Cystic Fibrosis Bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (10), 1078-1083 (2010).
Werlin, S., et al. Genetic and electrophysiological characteristics of recurrent acute pancreatitis. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 60 (5), 675-679 (2015).
Dransfield, M. T., et al. Acquired Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Dysfunction in the Lower Airways in COPD. Chest. 144 (2), 498-506 (2013).

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Citar este artigo

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).