Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

George M. Solomon; Inez Bronsveld; Kathryn Hayes; Michael Wilschanski; Paola Melotti; Steven M. Rowe; Isabelle Sermet-Gaudelus

doi:10.3791/57006

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Medicina

코 막 Transepithelial 잠재력 차이 (NPD)의 표준화 된 측정

Published: September 13, 2018

doi:

10.3791/57006

George M. Solomon¹, Inez Bronsveld², Kathryn Hayes³, Michael Wilschanski⁴, Paola Melotti⁵, Steven M. Rowe¹, Isabelle Sermet-Gaudelus^6,7

¹Department of Medicine and the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center,University of Alabama at Birmingham, ²Department of Pulmonology and Tuberculosis,University Medical Center Utrecht, ³Center for Experimental Medicine,Queens University, Northern Ireland, ⁴Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, ⁵Centro Fibrosi Cistica,Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata, ⁶Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques and Center de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose,Hôpital Necker Enfants Malades, ⁷INSERM U 1151,Institut Necker Enfants Malades

Summary

여기, 우리 코 전위차 (NPD)를 측정 하는 표준화 된 프로토콜을 제시. 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 기능 평가 전압에서 변화에 의해 비 강 상피에서 이온 채널 활동을 수정 하는 솔루션의 superfusion 후 제공 하는 결과 측정입니다.

Abstract

우리는 비 강 전위차 (NPD)의 표준화 된 측정을 설명합니다. 이 기법에서 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 및 상피 나트륨 채널 (ENaC) 함수는 모니터링 전압에서 변화에 의해 비 강 상피에서 이온 채널을 수정 하는 솔루션의 superfusion 후 활동입니다. 이 열 등 한 코 비 접촉 카 테 터를 이용 하 여 콧구멍에 피하 구획과 기도 상피의 잠재적인 차이의 측정으로 사용 됩니다.

테스트 수 100 µ M amiloride, 벨의 솔루션;⁺Na 재흡수의 억제제의 재 관류 후에 안정적인 기준 전압 및 연속 순 전압 변화를 측정 드라이브 염화 물 분 비를 amiloride 및 10 µ M isoproterenol amiloride 순환 아데노신 monophosphate (캠프)를 자극 하는 염화 무료 솔루션에 포함 된 염화 무료 솔루션-종속 염화 전도도 CFTR 관련.

이 기술은 두 가지 주요 구성 요소 호흡 상피, ENaC, CFTR의 기도 표면 액체의 수 분을 수립의 electrophysiological 속성을 보여주는 장점이 있습니다. 따라서, 단계 2 및 낭 성 섬유 증 (CF) 폐 질환의 치료를 위한 CFTR과 ENaC 활동 대상 에이전트의 개념 재판의 증거에 대 한 유용한 연구 도구입니다. 그것은 또한 유전자 검사와 땀을 테스트는 모호 CFTR 역 기능을 설정 하는 것 키 후속 절차입니다. 땀 염화, 테스트는 달리 상대적으로 더 많은 시간이 소모 하 고 비용이 많이 드는. 또한 통신 수 훈련 및 전문 지식을 효과적으로 테스트를 수행이 필요 합니다. 인테르-와 intra-subject 가변성 특히 젊은이 나 비협조적인 주제에에서이 기술에 보고 되었습니다. 이 우려와 함께 돕기 위해, 해석은 최근에 유효성이 검사 된 알고리즘을 통해 개선 되었습니다.

Introduction

이 방법의 전반적인 목표 측정 코 전위차 (NPD) 트랜스 상피 이온 수송 vivo에서¹을 조사 하는 것을 목표로 하는 것입니다. 이 기술은 나트륨 (Na⁺) 및 염화 물 (Cl^–)의 측정을 허용 한다. NPD는 1980 년대 후반 이후 연구 도구로 사용 되었습니다과 낭 성 섬유 증 기초 (CFF) 합의 문을² , 낭 성 섬유 증 기초 (CFF) 합의 진단 가이드라인에 2017 진단 절차로 1998 년에 허용 했다 ³. 실제로, CF의 원인에는 생물학적 CFTR 부전 Cl^– 분 비에서 꼭대기 막 및 결함에는 증가 나⁺흡수에 의해 입증 됩니다. 이 기능 테스트 유전학 비 결정적인 불확정 중간 땀 테스트 결과³환자의 경우는 추가 진단 도구 활용을 제공 합니다. 그러나이 정보는 또한 장 전류 측정 biopsies (ICM)에 의해 얻을 수 있습니다, 비록 ICM은,, 몇 가지에 사용할 수 있는 센터를 세계적으로 하 고 표준화를 더 요구. NPD 더 사용할 수 약 60 글로벌 센터에서 이며, 또한, 대상 질병의 주요 위치는 호흡기 상피.

CFTR 활동에 제공 하는 정보를 감안할 때, 그것은 또한 CFTR 단백질의 기능 복원 평가를 목표로 개념 증명 연구에 의해 사용 변조기 요법⁴^,^,⁵⁶^,⁷^, ⁸. 실제로, CFTR 유전자를 mRNA/편집, CFTR potentiator, 및 교정기 치료 연구에서 데이터 Cl^– 에 상당한 변화를 강조 하 고 나⁺ 치료⁶^,⁹ 수송 NPD 수 확인 한 임상 시험에 응답 끝점입니다. 우리는 중요 한 임상 끝점 짧은 기간에 환자의 임상 상태에 미묘한 변화를 감지할 수 부족,으로이 전 임상 바이오 마커 매우 유익한 수 있습니다. CFTR 변조기 치료 분야를 넓혀 신속 하 게 그리고 우리는 급히 테스트에서 비보에 큰 단계 3 재판¹⁰에 가기 전에 활성 화합물을 신속 하 게 해독 수 있는 필요.

기술은의 생리 적인 근거는 콧구멍에서 기도 상피와 피하 실 사이의 전위차의 측정을 기반으로 합니다. 이온 채널 활동의 변화 나⁺ 흡수 관련는 ENaC 차단 후 안정적인 최대한 기준선 잠재적인 차이 (PD), 측정 하 고 다른 꼭대기 Cl^– 전송기를 통해 Cl^– 분 비를 운전 하 여 탐험 하 CFTR 포함 하 여. CFTR 부전 캠프 종속 통로 통해 Cl^– 분 비의 자극에 따라 전위차에 최소한의 변화에 의해 표시 되 고 증가 ENaC 중재 나⁺ 흡수 더 부정적인 baseline 전위차에 의해 감지 그리고 amiloride에 대 한 향상 된 응답입니다. 일반 경찰 대 CF에 대 한 기계적으로 그림 1에 요약 됩니다.

그림 1: 이온 채널 활동의 요약 그림. 호흡 상피 시연에서 활동 균형 CFTR 활동 결과 ENaC CFTR 정상적인 과목에서의 활동 및 (B) (A) 이온 ENaC 중재 나트륨 수송 증가 하 고 감소 CFTR 종속 염화 교통입니다. ENaC: 상피 나트륨 채널, 나⁺: 나트륨, CFTR: 낭 성 섬유 증 막 횡단 레 귤 레이 터, CL^–: 염화, mV: 밀리, PD: 전위차, 분: 분/s 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그러나,이 테스트는 변화 모두 동일한 유전자 형을 가진 환자 중 동일한 환자에서 반복된 측정에서의 어느 정도 보여 줍니다. 이것은 변조기 치료 후 변화의 해석을 촉진 하기 위하여 매우 중요 하다. 또한, 우리는 여전히 유효한 임계값 CF와 건강 한 주제 사이 차별 부족 합니다. 이 고용 기술과 임상 시설의 가용성 사이의 차이 부분적으로 있을 수 있습니다. 따라서, 상당한 국제적인 노력을 시험의 표준화를 목표로 진행 중 이다. 미국 CFF TDN (낭 성 섬유 증 재단 치료제 개발 네트워크)와 ECFS CTN (유럽 낭 성 섬유 증 협회 임상 실험 네트워크) multicenter 및 연구 실험에 있는 NPD 표준 운영 절차 (SOP) 사용에 대 한 만들었습니다. CTN TDN의 전문성을 결합, 결합, 국제 SOP CTN TDN에 의해이 최근 공동 작업 결과 (2014)¹¹. 이 종이 CF 진단 또는 개념 증명 시험 조사 시작 NPD를 고용 프로토콜 및 테스트 기술을 제공 합니다. 기술을 구현 하는 각 센터는 그것의 기관 인간 연구 윤리 위원회의 승인을 위해 응용 프로그램에 대 한 책임.

그림 2: 전체 회로도 NPD 설치 권장. Note 순차적 관류 펌프, 등 4-정지-거 시기 시리즈 설치 권장된 설치 표시 되는. 특정 연결 및 구성의 예는 SOP에 표시 됩니다. (솔로몬, G.M. 가슴, 2010¹³허가 수정 다이어그램) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2, 전극 및 높은 임피던스에 연결 된 둘 다 피하 공간에 배치 상피 표면 및 참조 다리에 탐험 다리 사이 NPD를 측정 하는 면에서 일반 실험 흐름을 설명 하는 전압계입니다.

이것은 2 다른 시스템에 의해 지켜진다: 2 허용 기준 전극 셋업이 있다: (i) 균형 Ag/AgCl 전극과 심전도 (ECG) 크림 가득 다리 피하 공간에 약간의 마모에 의해 연결 된 또는 (ii) 포화 calomel half-cells는 agar 22-24 게이지 바늘 피하 소개 가득. 비 강 점 막에 접촉 더블 루멘 카 테 터에 의해 사용 됩니다. 1 루멘 agar 또는 ECG 크림으로 채워지고 측정 전극에 연결, 다른 관류 비 강 점 막에 다양 한 솔루션의 수 있습니다.

탐험 튜브의 끝에는 열 등 한 비 강 비 (그림 3) 호흡기 점 막에 배치 됩니다.

그림 3: 호흡기 점 막에 튜브를 탐구의. (A) 외부 보기 표시 배치. (B) Rhinoscopic 보기 배치를 보여주는. (C) 다이어그램 카 테 테 르 배치에 대 한 해 부 위치를 나타내는. PD: 잠재적인 차이

공부 하 고 여러 가지 약물에 대 한 PD의 응답, superfusion 솔루션은 테의 두 번째 루멘을 통해 적용 됩니다. 준비 및 데이터 분석을 통해 초기 준비에서 프로토콜 아래 상세 NPD 측정의 행위에 관한 몇 가지 주요 단계가 있습니다.

솔루션 및 전극의 준비, 후 전극 카 테 터의 적절 한 품질 테스트는 테스트의 기본 행위에 대 한 수 있습니다. 기저 측정 등 비, 다양 한 측정을 위한 최고의 장소를 수 있는 따라 만들어집니다 가장 부정적인 측정으로 일반적으로 하는. 다음 순차 perfusions Na⁺ (ENaC) 및 Cl^– 비 강 상피에서 전압에서 변화를 통해 (CFTR 종속) 이온 플럭스를 결정합니다.

Protocol

인체와 관련 된 프로토콜 모든 참여 학회 연구 위원회에 의해 승인 되었다. 기술을 구현 하는 각 센터는 그것의 기관 인간 연구 윤리 위원회의 승인을 위해 응용 프로그램에 대 한 책임. 1. 솔루션 준비 솔루션 #1, # 2와 #3, 프로시저 및 저장 된 현장 (표 1) 이전 1 L 배치에서 기본 솔루션을 준비 합니다.참고: Amiloride 빛에 민감한 이며 어둠에 저장 되어야 합니다 (솔루션 구성에 대 한 표 1 참조) (자세한 솔루션 준비11에 대 한 SOP를 참조). PH 7.4와 0.22 μ m 병 상단 필터와 필터에서 모든 솔루션을 버퍼링 합니다. 솔루션 # 3에 대 한 포함 하는 인산 염을 먼저 추가, 결정 (참조 표 2 솔루션 구성에 대 한)을 방지 하기 위해 이온화 하도록 허용.참고: 혼합 순서는 솔루션 # 3에 대 한 중요 한. (3 개월 안정) 4 ° C 또는-20 ° C (6 개월 안정)에서 이러한 솔루션을 저장 합니다. NPD 테스트의 날에 에이전트를 추가 하 여 솔루션 # 4와 # 5를 준비 합니다. Isoproterenol 빛과 산화 민감한 이며 그것은 (시연 4% 감퇴 4-8 ° C에서 4 시간 이상) 실내 온도에 그것의 활동을 잃는다. 4 ° c.에 게참고: ATP는 빛과 산화 민감한 ( 표 3참조). 화합물 분자량 농도 (mM) 구성 (g/L) NaCl 58 148 8.58 CaCl2 2 H2O 147 2 월 25 일 0.33 KCl 75 4.05 0.3 K2HPO4 174 2.4 0.42 KH2 포4 136 0.4 0.05 MgCl2 6 H2O 203 1.2 0.24 표 1: 솔루션 구성입니다. 화합물 분자량 농도 (mM) 구성 (g/L) 나 글 루 콘 산 218 148 33.26 Ca Gluconate 430 2 월 25 일 0.97 K 글 루 콘 산 234 4.05 0.95 K2 HPO4 174 2.4 0.42 KH2 포4 136 0.4 0.05 MgSO4 7 H2O 246 1.2 0.24 표 2: 솔루션 구성입니다. 솔루션 솔루션 번호 내용 EDC 마크 명종 장치 주입 솔루션 #1/A 주입에 대 한 버퍼링된 ringers 명종 장치 명종 장치 + amiloride 솔루션 #2/B 버퍼링 된 ringers + 100 μ M amiloride AMIL Cl- + amiloride 0 솔루션 #3/C 제로 Cl- + 100 μ M amiloride 버퍼링 OCL Cl- + amiloride isoproterenol 0 솔루션 #4/D 제로 Cl- + 100 μ M amiloride + 10 μ M isoproterenol 버퍼링 ISO Cl-+ amiloride + isoproterenol ATP 0 솔루션 #5/E 제로 Cl- + 100 μ M amiloride + 10 μ M isoproterenol 100 μ M ATP 버퍼링 ATP 표 3: 솔루션 목록입니다. 2입니다. 카 테 터 PVC, 살 균, 단일 사용, 2 루멘 (0.7 m m 내부 Ø) 카 테 터를 사용 하 여 한 라운드와 부드러운 말단 (2.5 m m 외부 Ø), 특별히 NPD에 대 한 설계와 함께. 측면 구멍, 2 mm 관류에 대 한 끝에 구멍 끝에 먼에 의해 점 막과의 접촉을 확인 (단계 10.1 참조). 측정 전극과 관류 펌프를 다른 하나에는 카 테 터의 두 Luer 잠금 연결 중 하나를 연결 합니다. 사용 채널 측정 루멘으로 파란색으로 물 들 다. 10 cm 각 0.5 c m 간격에 테를 태그.참고: 죽은 공간 0.3 mL 이다입니다. 카 테 터의 준비가 가능 하지 않으면 다음 두 단계를 수행에 대 한 위의 절차를 사용 하는 것이 바람직합니다. PE50 및 PE90 카 테 테 르 튜브의 평등 (~ 76 cm) 길이 잘라. 실리콘 고무 튜브의 1 cm 조각에 함께 부착. 25 G 무딘 팁 바늘 snuggly PE 90 튜브의 반대쪽 끝으로 삽입 합니다. 25 G 나비 바늘 snuggly을 배치로 튜브 펑크 확인 PE50 튜브의 반대쪽 끝으로 삽입 합니다. 그림 4: NPD 측정을 위해 사용 하는 카 테 테 르. 삽입 상자 측정 구멍을 가진 카 테 터 팁을 보여 줍니다. 3. 한 천 피부 다리 (나비 바늘) 및 카 테 터의 준비 참고: 녹은 한 천 조작 화상, 발생할 수 있습니다 그리고이 신중 하 게 이루어져야 한다. 3% agar agar의 3 세대 솔루션 #1 넓은 입 병에서의 100 mL와 혼합 하 여 준비 합니다. 용 해 될 때까지 전자 레인지에 한 천 녹 (투명). 따뜻한 한 천으로 10 mL 주사기를 채우십시오. 나비 바늘 (23 G)와 카 테 터의 표시 루멘 주사기를 연속적으로 연결 합니다. 주사는 한 끝에 나타날 때까지. 그것은 적어도 10 분 동안 냉각 허용. 확인 한 피부 다리 및 카 테 터는 완전히 가득 기포의 자유를 시각. 4 ° C에서 #1 솔루션에서 대량 피부 다리를 저장 하 고 1 주일 후 사용 하지 마십시오. 4. 사용 ECG 크림 ECG 크림 솔루션 #1 (1:1, v/v 벨)을 희석. 때까지 공기 방울의 무료 휴식 하자. 희석 ECG 크림 10 mL 주사기를 채우십시오. 카 테 터의 표시 루멘에 주사기를 연결 하 고 그것은 더 낮은 측면 구멍에 나타날 때까지 천천히 ECG 크림을 주입. 테 완전히 채워진와 공기 방울의 무료 인지 확인 합니다. 5. 데이터 수집 시스템 참고: 데이터 수집 시스템의 일반적인 설치는 그림 5에 표시 됩니다. 그림 5: 데이터 수집 시스템의 설정. Bioamplifier 및 headstage 컴퓨터 인터페이스의 연결 뿐만 아니라 전극 연결 headstage11을 시연. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 연결 USB 케이블로 데이터 수집 시스템 (자료 테이블)에 컴퓨터를 연결 합니다. 에 연결 하려면 데이터 수집 시스템은 bioamplifier, bioamplifier (뒤)에 출력 데이터 수집 시스템 (앞)에 입력 채널 1에서에서 BNC 케이블을 연결 합니다. 미리는 bioamplifier 앞 입력된 부분에 headstage 나사에 연결 된 사용자 정의 케이블은 headstage에는 bioamplifier를 연결 합니다. 전극과 접지 전극에는 headstage를 연결 합니다. 표준 2 m m 여성 여성 커넥터를 사용 하 여 headstage의 전면 전극에 연결 하.참고: 포트는 최근 및 2 m 케이블의 한 방향에만 맞는: (비 강 카 테 터);를 통해 환자 코 레드 측정 전극 블랙-참조 전극 환자 피부 다리; ECG 전극에 흰색의 피부에 기초. 설명으로 bioamplifier를 설정: 오프셋: 활성화, 조정, 조정; 후 가져온된 위치에 두고 턴을 전압: DC; 1 mV 칼: 중립 위치; 전원:에 데이터를 수집 하려면 오프 충전 배터리; 이득: 10;로 설정 밴드 패스: LoFreq (외부 손잡이): DC; 밴드 패스: HighFreq (내부 손잡이): 1khz; 볼륨: 오프. 6. 머리 단 오프셋 조정 SOP11에 표시 된 대로 노트북 및 시퀀스에 앰프를 연결 합니다. 데이터 수집 시스템을 노트북 (시퀀스 데이터 수집에 사용 되는 장치를 인식 하는 소프트웨어에 대 한 중요 하다)에 전환. SOP 순서에 의하여 머리 단계 오프셋 조정 합니다. 7입니다. 오프셋 참고: 여러 오프셋 전기 측정 시스템의 안정성을 보장 하기 위해 테스트할 수 있습니다. ( 그림 6참조) 전극 오프셋에 대 한 배치 참조 (네거티브) 전극과 측정 (긍정적인) 전극 함께 희석된 ECG 크림 또는 3 M KCl. 확인 전위차 전극 사이 읽고는 headstage에 0 근처입니다. 카 테 터 및 피부 브리지 오프셋을 설정 하기 위한 측정 (긍정적인) 전극과 목욕으로 비 강 카 테 터의 Luer 잠금 끝 또는 피부 다리의 Luer 잠금 끝을 놓습니다. ECG 크림 욕조 또는 3m KCL 포함 하는 전위차가는 headstage에 0 가까이 있도록 참조 (부정적인) 전극에 테의 다른 쪽 끝을 놓습니다. 폐쇄 루프 오프셋을 설정 하려면, 확인 회로 전극의 목욕에서 비 강 카 테 터를 교체할 때 닫힙니다. 폐쇄 루프 0 읽기 오프셋 확인 mV (‘오프셋’; = ± 2.5 mV). 0을 오프셋을가지고 headstage 오프셋된 노브를 조정 mV.참고:이 회로 내에서 모든 연결은 그대로 확인 합니다. 코 테 그대로 하지 않을 수 있습니다 하지 경우 (공기는 agar 또는 ECG 크림에 거품). 한 다리를 변경 하거나 설정에서 ECG 크림을 밀어. 전극 오프셋 수행 해야 합니다 처음, 다음 폐쇄 시스템 (폐루프 오프셋) 전극과 다리 (그림 6). 그림 6: 오프셋 (A) 전극 오프셋, (B) 카 테 터 (또는 다리)의 설치, (C) 닫힌된 루프 오프셋입니다. 8. 주사기 설정 참고: 다음 권장된 설정입니다. 솔루션 #1, # 2와 # 3를 녹여 약 1 h는 측정 하기 전에. 카 테 터에 가까운 자 지에 확장 라인을 연결 합니다. 모든 펌프에 스위치와 stopcocks는 거품의 명확한 때까지 완전히 테 오프 플러시 솔루션 #1 카 테 터를 플러시. 9. 참조 및 측정 전극의 배치 그림 7: 제목 측정 전극과 피하 브리지 측정을 위한 준비. 장착 위치 NPD 연산자를 직면 하 고 연구 주제를가지고. 안락 더를 위한 선택적인 정전기 방지 매트와 orthoptic 턱 나머지에 머리에 피트를 놓습니다. 지상 리드 전극의 팔 (그림 7)에 위치 하는 ECG 패드에 연결 합니다. 등 팔 뚝 (agar 시스템)에 피하 주사 바늘을 삽입 하거나 팔 뚝에 이전 최소한 침식된 지역에 크림 ECG에 적용할 참조 전극 (포인트 7 단계 10 아래 참조). 피부 (손가락 PD)와 전위차를 측정 하 고 본인의 엄지 및 집게 손가락의 끝 사이 카 테 터를 곤란 하 게 하 여 “측정 구멍”을 주제를 요구 하 여 공간을 피하의 연결을 확인 합니다. 없으면 손가락 PD-30 mV 이상 네거티브, 나비 바늘의 삽입을 확인. (ECG 크림 설정)에 대 한 마모를 반복 하 고 다리를 확인 하십시오. 오른쪽 콧구멍으로 80 mL/h. 시작에서 솔루션 #1 주사기 펌프를 시작 합니다. 지속적인 부정적인 전압으로 손가락 PD 측정 (일반적인 범위-40 ~-80 mV). ECG 크림 시스템을 사용 하는 경우: ECG 크림 1:1 희석 하 고 이전는 Agar에 대 한 본 조사 구멍에서 완전 플러시 후 테를 작성. 전극, 전극 오프셋 및 세트에서 다리에 대 한 검사 수 있도록 목욕 ECG 크림 가득한 반 50 mL 주사기에 카 테 터를 연결 합니다. 피부의 약간의 이전 최소한의 마모에 의해 피하 공간 기준 전극 Ag/Cl를 연결, 피부 나타납니다 ‘핑크와 빛나는’ 피의 수준에 도달. ECG 크림, 침식된 피부에 덮여 측정 전극 위치. 손가락 PD 이전 한 시스템에 대 한 표시를 확인 하십시오. 10입니다. 기저 PD의 측정 조명 rhinoscope (또는 동급) 비 열 등 시각화를 사용 하 여 오른쪽 콧구멍에 코 카 테 터를 삽입 합니다. 랜드마크로 앞쪽 끝을 사용 하 여, 호흡기 점 막에 비 열 등의 열 등 한 사이트를 대상으로 테 사전. 또는, 배치 어려운 경우는 콧구멍의 바닥 접촉 프로브 구멍 배치할 수 있습니다.참고: 카 테 터는 충분히 엄밀한 연산자는 콧구멍으로 안내. 배치를 촉진 하기 위하여 테의 1 채널 블루에서 색 하 고 비 열 등 접촉 프로브 옆 구멍을 포함. 카 테 터 회전이 되지 않습니다. 1에서 10 cm에 카 테 터에 표시 된 마크 쉽게 참조 포인트를 제공 합니다. 비 열 등에서 PD를 측정 합니다. 이 위해 카 테 터의 측정 구멍 열 등 한 비 (오른쪽 기초에서 마크)의 점 막에 대 한 그것의 배치에 의해 닫혔는지 확인 합니다. 3.0, 2.0, 1.5, 1.0, 및 0.5 cm (비 열 등에서 열 등 한 도관 내의 거리)에서 PD 측정: 오른쪽 기저 PDs 표시. 약 5에 대 한 지정 된 거리에서 각 측정을 유지 s 각 꾸준한 독서 (± 1 mV)를 보장 하 고 기저 PD 값의 정확한 해석을 촉진 하기 위하여. 왼쪽 기저 PDs (3cm, 2cm, 등)과 왼쪽 기저에서 기능 키를 사용 하 여 왼쪽된 콧구멍에서 위의 단계를 반복 합니다. 가장 부정적인 신호의 사이트에 비 강 카 테 터의 프로브를 삽입 가이드로 기저 PD 측정을 사용 하 여 (최대 3cm 비 열 등 한 코의 앞쪽 끝에서), 및 코 (또는 동급)의 끝에 테이프의 작은 조각. 11입니다. NPD 순차적 Perfusions 추적 오른쪽 콧구멍에 대 한 솔루션은 환자의 코를에서 물 떨어지는 확인 합니다. (종종 그들의 손에 자신의 머리를 휴식 하거나를 chinrest 또는 다른 immobilizing 장치를 사용 하 여 주제를 함으로써 도움) 아래로 그들의 머리와 편안한 위치를 가정 하는 주제에 있다. 움직임을 최소화 하 고 코에 튜브를 만지지 마십시오 하 고 이야기를 피하기 위하여 주제를 생각나 게 한다. 솔루션 # 1을 설정 (Ringers) 펌프 (5 mL/min, 또는 300 mL/h). 안정적인 값을 얻을 때까지 기록 (< 1 mV 변경/30 s).참고: 이것은 안정성을 달성 하기 위해 약 3 분. 솔루션 #1 관류를 해제 합니다. 솔루션 #2 (Amiloride)는 재 관류를 시작 합니다. 3 분의 최소 NPD를 기록 (대 지 전압은 의심에서, 계속 5 분까지 총에 대 한 녹음). 솔루션 #3 (제로 염화 비닐)는 재 관류를 시작 합니다. 3 분의 최소 NPD를 기록 (경우 대 지 전압, 최대 5 분 총에 대 한 녹음을 계속). 솔루션 #4 (Isoproterenol)는 재 관류를 시작 합니다. 3 분의 최소 NPD를 기록 [고원 전압 경우 (적어도 30에 대 한 꾸준한 전압 추적 < 1 mV의 s), 최대 5 분 총에 대 한 녹음을 계속]. 솔루션 #5 (ATP)는 재 관류를 시작 합니다. 응답 hyperpolarizing 피크를 얻을 때까지 1 분의 최소 기록 npd 그룹. 솔루션 #1 (명종 장치)와 관류에 설정 하 고 있도록 30 테를 s. 솔루션 #1 관류를 해제 합니다. 왼쪽된 콧구멍에 대 한 절차를 반복 합니다. 12입니다. 시험의 끝 다시 확인 하 고 5에 대 한 안정적인 손가락 PD (이 하 “게시물 손가락”) 기록 s. 피부에 삽입 사이트에서 피사체의 피부 다리와 붕대를 제거 합니다. AgCl/ECG 크림 시스템에 대 한 팔에서 전극을 제거 합니다. 초기 폐쇄 루프 오프셋 측정에 대 한 설명 된 대로 “마지막 폐쇄 루프 오프셋” 전압을 기록 (단계 7.1.3 참조). 기능 키와 함께 마지막 오프셋을 표시 합니다. 데이터 수집을 중지 (언론 “”를시작).참고: 현재 SOP purinergic 칼슘 의존 Cl- 분 비, 테스트;에 대 한 긍정적인 통제 역할을 활성화 하기 위해 100 µ M ATP의 사용을 권장 그러나, 이것은 선택 사항 테스트입니다.

Representative Results

일반 기도 epithelia, 나+ 흡수는 기본 이온 전송 활동. 이 결과 interstitium에 관해서는 부정적인 기도 표면 전위 차이. 관류 ENaC 채널 차단제 amiloride의 덜 부정적인 잠재적인 차이 이끌어 낸다. Cl-의 다음, superfusion-무료 솔루션 Cl-, 더 많은 부정적인 전위차는 CFTR 등 모든 Cl- 전송기를 활성화에 대 한 화학 그라디언트를 만듭니다. 세포내 cAMP를 증가, Isoproterenol 더 특별히 CFTR 활성화 하 여 Cl- 분 비를 증가 하 고 잠재적인 차이 증가. 대조적으로, CF 과목에서 결 석 또는 역 기능 증가 ENaC에 CFTR 결과 중재 나+ 흡수12. 그 결과, 초기 잠재적인 차이점은 더 많은 부정적인. 반면에 최소한의 도발은 amiloride의 응용 프로그램과 함께 관찰은 더 큰, 또는 CFTR 종속 경로 통해 Cl- 분 비의 자극에 따라 전위차에 아무런 변화가 없습니다. 이 그림 8, ‘건강 한’ vs ‘CF’ 경시를 보여주는 대표적인 경시에서 볼 수 있습니다. 그림 8: ‘건강 한’ 주제 및 참조와 제목의 대표적인 경시 PD: 전위차, ΔAmiloride: 델타 amiloride, /Iso 0 Cl–: 낮은 염화: 솔루션 #2 및 #4 솔루션 관류, s 1-s 4 사이 경찰에 변화: 단계 1-4, 녹색 라인 그래프 A와 B에 NPD 추적 및 검정 나타냅니다 화살표는 잠재적인 차이에 차이 나타냅니다.

Discussion

Vivo에서, NPD 경도 기준 반복적으로 수행할 수 있는 독특한 측정을 제공 하 고 반복 측정, 비슷한 경도 결과 group-wise이 고 개별 기준¹⁴^{에 관찰 된다 보여줍니다.} ¹⁵. NPD 비 CF에서 CF를 구별을 위한 우수한 차별 타당성 있다는 강력한 증거가 있다. 25 학문 Cl^– 에서 통계적으로 유의 한 차이 나⁺ 계수 CF 환자와 건강 한 컨트롤¹⁰사이 일관 되 게 설명 했다. 여러 이전 개발된 인덱스 설명이 용량, 하는 동안 우리는 새로운 업데이트는 필요한 방법론⁷^,⁸의 최근 규격화를 주어진 예상.

수정 및 문제 해결

이 테스트는 정확한 측정을 보장 하기 위해 몇 가지 주요 단계가 필요 합니다. 시스템 권장된 기준에 수행 되도록 전극 및 카 테 터 폐쇄 루프 오프셋을 포함 됩니다. 환자 여전히 유지 하 고 아티팩트 및 카 테 터 dislodgement 최소화로 이야기 참 해야 합니다. 이것은 테스트 비 협력 환자에 어렵게 하 고 기술을 나이⁷의 6 세 미만 어린이에 대 한 연구에서 보고 되었습니다.

비 강 상피의 사전 검사는 쌓여 또는 측정에 영향을 미칠 수 있다 상피에 점액 인지 확인 해야 합니다.

매우 중요 한 것은, 그것은 해야 합니다 지적 테의 배치의 위치 논쟁의 주제 이다. 여기에 제시 된 SOP 활용 (그것) 비 열 등에서 측정 합니다. IT에서 카 테 테 르의 배치를 표준화 하 고 실시 하 되 재판에서 그리고, 따라서, 이것은 권장된 기술 이다. IT에서 측정 하기 어려울 수 있습니다 유지 비 강 점 막과 회사 접촉에서 솔루션 연락 되 고 하는 동안 사이드 홀 테 수행 됩니다. 다른 그룹은 기술적으로 쉽게 비 강 바닥에 PD 측정할 수 있습니다. 중요 한 것은, Vermeulen (2011) 2 방법 비교¹⁶는 보여주었다.

솔루션의 온난화 유럽과 미국 센터¹⁷^,¹⁸사이 토론의 사정은 남아 있다. 그것은 되어 주 창 하고있다 그 관찰된 총 염화 응답 증가 22 ° C 대신 37 ° C에서 솔루션을 사용 하 여 약 25%, isoproterenol 종속 염화 응답 약 95¹⁸에서. 그러나, 온난 증가 가변성,¹⁷의 총 염화 반응 더 큰 표준 편차에 의해 평가 합니다. 따라서 온난화 솔루션 가변성의 추가적인 요소는, 연구 기초에 요구 되지 않는 한 솔루션 따뜻한 않기로 합시다.

우리는 이전 두 전극 기술을 비교 하 고 AgCl 및 Calomel 전극 시스템에서 정상적인 과목¹³기저 및 자극 전류에 유사 하 게 운영 발견.

기술의 한계

이 테스트는 중요 한 주제 내에서 변화. 득점의 가변성 불확정 경시 환자에서 특히 유행 이며이 진단 응용 프로그램¹⁹에서 설명 되어야 한다. 변화의 요인 포함 급성 상부 호흡기 감염, 광범위 한 비 강 폴립, 사전 부 비 동 수술 및 CF 관련 염증 그것의 특이성, 감도²⁰^,¹⁰감소 하 게 됩니다. 또한, 경시의 해석은 다를 수 있습니다 독자 사이 비록 전문가 독자 보여 양적 점수 및 CF에 비 CF 경시, 판독의 우수한 계약에 상당한 가변성 대조는 추적¹⁹의 자신감입니다.

중요 한 임계값 대 본질적인 가변성

매우 중요 한 것은, 측정의 생리 적인 다양성은 다른 연구¹⁰, 염화 총 전송에서 변화에 있는 상당한 가변성을 시연 CFTR 유전자 치료 실험 등에서 볼 수 있듯이 상당한, 그리고 amiloride²¹^,²²범위. 횡단면 평가 나왔다는 Cl^– -7-5의 임계값 isoproterenol 응답 플러스 0 mV는 CF와 CF 비 과목¹⁰사이 커트 오프.

우리는 그럼에도 불구 하 고 단계 II 평가판에서 효과적인 CFTR 보정을 대표 하는 질병 치료 수정으로이 매개 변수는 변경의 크기에 대 한 명확한 지식이 부족 합니다. 개별 응답을 평가 하는 개입에 대 한 응답을 모니터링 하는 반복된 테스트 본질적인 가변성에서 중요 한 변화를 구별 하 필요할 수 있습니다. 매우 중요 한 것은, 수정 약 병 미래 장기 연구 CFTR 기능 개선 CF의 임상 관련성이 높은 결과 또는 (FEV₁개선) 같은 대리 결과 개선 연결 설명 필요 질병입니다. 실제로, 최근 단계 II Ivacaftor 연구 시연 염화 분 비²³에 작은 개선에도 불구 하 고 임상 혜택 표시.

이러한 연구는 트랜스 상피 Cl^–전도도 개선의 컷오프 값 임상 혜택을 위한 대리 매개 변수 있을 경우 설정 하는 데 도움이 됩니다. CFTR 수정 치료의 개발 지침에 대 한 중요 한 매개 변수 것입니다.

기존의 방법에 관하여 의미: 땀 테스트 및 장 전류 측정 (ICM)

‘ 의심 ‘ 낭 성 섬유 증 환자에서로 의해 평가 중간 땀 30 그리고 60 m m, NPD 합성 점수 ‘ CF-가능성이 ‘ 환자를 진단 하는 매우 중요 한 도구를 제공 하 고 ‘ CF-가능성 ‘^{10 사이 농도 Cl^–}. 장 전류 측정 (ICM), net Cl^– 직장 상피에 걸쳐 용의 비보 전 측정을 제공 하 또한 수 잔여 CFTR 함수의 높은 감도와 CFTR 높은 표현 때문에 이 상피.

CFTR 변조기에 의해 CFTR 기능, 이러한 CFTR biomarker 변화 사이 관계의 수정 고려는 현재 불분명. 하지만 최근 작품에 따라 Ivacaftor 결정 NPD와 땀 테스트는 상관된⁴, 그것은 아직 설립 되지 경우 호흡기에서 측정 보다, 예를 들어 호흡 결과의 더 나은 예언자, 땀 테스트²⁴ ^, ²⁵ 또는 ICM에서 변경입니다. 또한, 한정자 약물 또한 그들의 기관 특정 신진대사에 달라질 수 있습니다. NPD에 관해서는 그것은 기저 PD 및 amiloride 응답에 변화에 나⁺ 전송, 표현 변경 0 Cl^– 및 isoproterenol 응답 익스프레스 Cl^– 전송 하는 동안 주의 하는 것이 중요. 그것은 아직이 더 중요 하다 질병 개량에 대 한 설정 이다.

이 기술의 미래 응용 프로그램

이 기술 사용 하 여 CF 필드 밖으로 예상 된다. 천식²⁶, 만성 기관지염²⁷, 아닌 CF 기관지 확장 증^{28 포함 하 여 항공 질병 장애를 설명 하기 위해 적용할 수 있습니다 때문에이 기술은 고유 나⁺ 및 Cl^– 이온 채널에 적합 한}및 재발 성 췌 장 염²⁹. 또한,이 기술의 수정³⁰만성 기관지염 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 환자에서 더 낮은 항공 집중 CFTR 부전을 보여 주기 위해 낮은 항공 (LAPD)에 사용 되었습니다.

NPD는 CFTR 함수는 모두 진단에 사용할 수 있습니다, 또한, CFTR 및 ENaC 수정 하는 것을 목표로 하는 증거의 개념 연구에 대 한 채널 변환 연구에서 활동의 biomarker를 민감한 vivo에서 제공 합니다. 이 트랜스 상피 함수의 경도 평가 허용 하 고 CF 각 환자에 대 한 가장 효율적인 교정기에 맞게 맞춤된 의학에 대 한 전략으로 약속을 보유 하고있다.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 CFTR의 기능 (임상 시험 네트워크, 유럽 낭 성 섬유 증 협회) 표준화 위원회 및 국가 자원 센터 작업 그룹 (치료제 개발 네트워크, 낭 성 섬유 증에 대 한 작업 그룹에 의해 지원 되었다 재단)입니다. 추가 지원 CF 재단에 의해 제공 되었다 (GMS에 클랜 FY09)와 NIH (SMR과 GMS에 DK072482).

Materials

KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital)	Fisher Scientific
Powerlab 4/30	AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier	AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200	AD Instruments
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher	Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher	AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject)	Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes	Fisher Scientific	13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm	Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.)	Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode	BIOPAC Systems	UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm	SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream	Fisher Scientific	Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device	PROMED Feeling	Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs	Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing	Fisher Scientific	427411
Becton Dickinson PE 90 tubing	Fisher Scientific	427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD	Fisher Scientific	508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m)	3M	1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US	Marquat	I0202US
1" X 10 yards silk tape	3M Durapore	1538-1
IV extension tubing (30", 50/box)	International Limited	IMN30
Three-way stopcock (50/box)	Medex	MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent)	Fisher Scientific	09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	427564
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	367283
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box)	Fisher Scientific	309653
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box	Fisher Scientific	309604
Single use sterile wipes (per institutional availability)	Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent)	Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable)	Fisher Scientific	430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard)	SureCare
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box)	Becton Dickinson	367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery	Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional)	Richmond Products, Inc	629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent)	Fisher Scientific	No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl	Spectrum		Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP	Spectrum		Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4)	Spectrum		Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder)	Spectrum		Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous)	Spectrum		Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O	Spectrum		Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP	Spectrum		Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 551; Size: 5gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O)	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule	Hospital Pharmacy		Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 5 L

Referências

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Citar este artigo

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).