הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים
Summary
הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.
Abstract
הרשתית היא רקמה מורכבת יוזם ו משתלב הצעדים הראשונים של חזון. תפקוד לקוי של תאים ברשתית מהווה סימן היכר של מחלות רבות מסנוור, טיפולים עתידיים-טיבית ההבנות הבסיסיות על הרשתית כמה שונה התאים לתפקד כרגיל. צובר מידע כזה עם שיטות ביוכימיות הוכיחו קשה כי תרומות של סוגי תאים מסוים הם הצטמצמו בחצרו תאים ברשתית. הדמיה רשתית חיה יכול לספק תצוגה של תהליכים ביולוגיים רבים על רמה של subcellular, בזכות מספר גדל והולך של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט. עם זאת, טכניקה זו כה הוגבלה ראשנים של הזחלים דג זברה, שכבות הרשתית החיצונית ביותר של הרשתיות מבודד, או הדמיה ברזולוציה נמוכה יותר של הרשתית בבעלי חיים. כאן אנו מציגים שיטה ליצירת חיים שמחוץ ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה בשידור חי דרך מיקרוסקופיה קונפוקלית. הכנה זו מניבה פרוסות רוחבי עם כל שכבות הרשתית ואת רוב סוגי תאים גלויים לביצוע ניסויים הדמיה קונאפוקלית באמצעות זלוף. דג זברה מהונדס לביטוי החלבונים פלורסנט או ביולוגיים סוגי תאים ברשתית מסוימים או organelles משמשים כדי לחלץ מידע מתא בודד רשתית העין שלמות. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות ברשתית עם צבעי פלורסנט מחוון, הוספת צדדיות של השיטה. פרוטוקול זה פותחה עבור הדמיה Ca2 + בתוך דג זברה חרוט photoreceptors, אבל עם סמנים תקין זה יכול להיות מותאם למדוד Ca2 + או מטבוליטים של תאים, התאים הפרעה דו קוטבית או אופקי, מיקרוגלייה, תאי אמקרין או רשתית מולר תאי גנגליון. אפיתל הפיגמנט ברשתית יוסר פרוסות כך שיטה זו אינה מתאימה ללמוד את סוג התא. בפועל, זה ניתן להפיק פרוסות טורי מחיה לחיה לניסויים מרובים. טכניקה זו הסתגלות מספק כלי רב עוצמה עבור לענות על שאלות רבות אודות ביולוגיה של התא רשתית, Ca2 +אנרגיה הומאוסטזיס.
Introduction
דג זברה (רזבורה rerio) להיות בשימוש נרחב רפואי ומחקר מדעי בסיסי1, בשל גודלו הקטן, פיתוח מהיר ומערכות איברים חוליות. השקיפות הטבעית של הזחלים דג זברה בשילוב עם שיטות הוקמה transgenesis אפשרו ויזואליזציה מפורטת של תהליכים תאיים בחיים. מספר של מקודדים גנטית ביולוגיים פלורסנט סומנו כמטרות לתאים דג זברה ספציפי כדי לזהות Ca2 + 2, מימן על-חמצני3, מוות הפעלה4 ו- ATP5
In vivo הדמיה של דג זברה הזחלים הוביל פריצת דרך בתחום של מדעי המוח, כולל מיפוי של המוח המעגלים6 , פיתוח תרופות עבור מערכת העצבים המרכזית הפרעות7. דג זברה מתאימים היטב לחקר הראייה שלהם כוללים את מבנה למינריות והסוגים נוירון של חולייתנים הגבוהים, הם מציגים התנהגויות חזותיים חזקים8,9. מספר סוגים של הרשתית degenerations מקביל מחלות אנושיות המודל בהצלחה ולמד דג זברה10,11, כולל הדמיה חיה של הפרט photoreceptors מושחת בתוך הרשתית2, 12.
בעוד ויוו דג זברה זחל הדמיה הוא כלי רב ערך, הוא הופך להיות יותר מאתגר כמו דגים לגדול ולהתפתח פיגמנטציה, טיפולי תרופתי כלשהו לא יכול לחדור חיה שלמה. יתר על כן, תהליכים תאיים מסוימים לשנות עם הגיל, ופיתוח עושה מאוחר יותר נקודות זמן קריטי עבור הפונקציה להבנה, התקדמות המחלה בבעלי חיים למבוגרים. שיטות ביוכימיות כגון immunoblot, quantitiative ה-PCR, צריכת2 O ניתוחים metabolomic יכול לספק רמזים חשובים על הביולוגיה של הרשתית בכללותה, אך קשה להבחין תרומות של סוגי תאים בודדים מושפע המחלה. הדמיה רקמת רשתית מבודד שמחוץ עוקף בעיות אלה, בעוד הדמיה במול הרשתיות הנטען מעניק תצוגה של הרשתית החיצונית13, תכונות ברשתית פנימי עמוק יותר מטושטשות. אופסין # רטינל רוחבי פרוסות, כגון אלה הציג באופן קבוע ניתוחים immunohistochemical, מאפשרים תצוגה ברורה של כל שכבות וסוגי תא אלא מציעים רק תמונה אחת של תהליכים דינמיים מעורב תפקוד תקין ומחלות.
כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת שמחוץ רוחבי ברשתית פרוסות של דג זברה למבוגרים עבור הדמיה. זה דומה שיטות להכנת פרוסות ברשתית דו-חיים, דג זברה מחקרים אלקטרופיזיולוגיות מורפולוגי14,15, עם שינויים חשובים עבור זמן לשגות הדמיה שמחוץ באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. קרינה פלואורסצנטית תגובות ביולוגיים או צבעי פרוסות מנוטרים בזמן אמת עם מיקרוסקופ קונפוקלי תוך אספקת סוכנים תרופתי באמצעות זלוף. בעוד השיטה פותחה עבור הדמיה photoreceptors, זה יכול להיות אפשרי להשתמש בו ליצירת אפקטים של תאים, תאים דו-קוטביים, תאים אופקיים, תאי אמקרין או תאי גנגליון מולר עם סמנים פלורסנט המתאים. בנוסף, ניתן לטעון פרוסות עם צבעי פלורסנט תא חדיר דוח תא הכדאיות, תחבורה vesicular, הפונקציה מיטוכונדריאלי או מצב חמצון-חיזור. בתכשיר רב תכליתי מאפשר הדמיה של מגוון רחב של תהליכים subcellular לאורך הרשתית, כולל Ca2 + דינמיקה, אותות, מצב מטבולי.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex-vivo הדמיה של דג זברה טריות פרוסות ברשתית הוכיחה להיות כלי רב-תכליתי ללמוד קולט אור ביולוגיה20,21,22, הוא ייחודי בכך שהוא מאפשר ניתוח של תאים בודדים בבוגרת, באופן מלא הרשתית הבדיל. בפועל, זה אפשרי לערוך ניסויים מרובים עם רקמת מדג יחיד, אפי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ראלף נלסון, דניאל Possin להדרכה מתחשב תוך פיתוח זה פרוטוקול, אווה, ג’ורג. אשלי, ואשתו, גייל סטנטון לדור של קווים דג זברה מהונדס יציב. העבודה נתמכה על ידי ה-NSF 2013158531 GRFP ל מ. ג, 5T32EY007031 NIH NEI ג’אקוזי, מ. ג, EY026020 ג’יי-אייץ, ס.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referências
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
