Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie
Summary
Imagerie tissu rétinien peut fournir des informations de cellule unique qui ne peut pas être recueillies de méthodes biochimiques traditionnelles. Ce protocole décrit la préparation de rétiniens tranches de poisson zèbre pour l’imagerie confocale. Fluorescentes codé génétiquement des capteurs ou indicateur colorants permettent la visualisation de nombreux processus biologiques en types distincts de cellules rétiniennes.
Abstract
La rétine est un tissu complex qui initie et intègre les prémices de la vision. La dysfonction des cellules de la rétine est une caractéristique de nombreuses maladies aveuglantes et thérapies futures dépendent de compréhensions fondamentale sur la rétine comment différente cellules de fonctionnent normalement. Obtenir ces informations avec des méthodes biochimiques s’est avérée difficile parce que les contributions des types de cellules particulières sont diminuées dans le milieu des cellules rétiniennes. Imagerie rétinienne direct peut fournir une vue de nombreux processus biologiques niveau subcellulaire, grâce à un nombre croissant de biocapteurs fluorescents génétiquement encodés. Cependant, cette technique a été jusqu’à présent limitée à des têtards et des larves de poisson zèbre, les couches rétiniennes ultrapériphériques des rétines isolés ou imagerie de résolution plus faible des rétines animaux vivants. Nous présentons ici une méthode pour générer des vivants ex vivo rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie live par microscopie confocale. Cette préparation donne des tranches transversales avec toutes les couches rétiniennes et la plupart des types de cellules visibles permettant d’effectuer des expériences d’imagerie confocale utilisant une perfusion. Poisson zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes ou biocapteurs dans les types de cellules rétiniennes spécifiques ou organites sont utilisés pour extraire les informations de la cellule unique d’une rétine intacte. En outre, tranches rétiniens peuvent être chargés avec indicateur fluorescent colorants, ajoutant à la polyvalence de la méthode. Ce protocole a été développé pour l’imagerie Ca2 + au sein de poisson-zèbre cônes photorécepteurs, mais avec des marqueurs de bon, il pourrait être adapté pour mesurer Ca2 + ou métabolites dans Müller cellules, cellules bipolaires et horizontales, cellules microgliales, cellules amacrines ou la rétine cellules ganglionnaires. L’épithélium pigmentaire rétinien est retiré des tranches si cette méthode ne consiste pas pour l’étude de ce type de cellule. Avec la pratique, il est possible de générer des tranches de série d’un animal pour des expériences multiples. Cette technique adaptable fournit un outil puissant pour répondre à nombreuses questions sur la biologie des cellules rétiniennes, Ca2 +et l’homéostasie énergétique.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) a devenu employé couramment dans la recherche scientifique médicale et base1, en raison de sa petite taille, de développement rapide et de systèmes d’organes vertébrés. La transparence naturelle des larves de poisson zèbre combinée à des méthodes établies pour la transgénèse ont permis une visualisation détaillée des processus cellulaires dans un animal vivant. Un certain nombre de biocapteurs fluorescents génétiquement codées ont été la cible de cellules spécifiques zebrafish pour détecter Ca2 + 2, peroxyde d’hydrogène3, apoptotic activation4 et ATP5.
L’imagerie in vivo des larves de poisson zèbre a donné lieu à des percées dans le domaine des neurosciences, y compris la cartographie du cerveau circuits6 et7de troubles de développement de médicaments pour le système nerveux central. Poisson zèbre conviennent bien pour la recherche de vision parce que leurs rétines présentent la structure laminaire et types de neurones des vertébrés supérieurs, et ils affichent des comportements visuels robuste8,9. Plusieurs types de dégénérescences rétiniennes analogues à la maladie humaine ont été modélisés avec succès et étudiées chez le poisson zèbre10,11, y compris l’imagerie direct des photorécepteurs individuels dégénérer dans une rétine2, 12.
En vivo imagerie de larves de poisson zèbre est un outil précieux, il devient plus difficile que les poissons grandissent et développent de pigmentation, et certains traitements pharmacologiques ne peuvent pénétrer un animal entier. En outre, certains procédés cellulaires changent avec l’âge et le développement faisant plus tard points dans le temps critique pour la fonction de la compréhension et la progression de la maladie chez les animaux adultes. Méthodes biochimiques tels qu’immunoblot, quantitative PCR, O2 consommation et métabolomique analyses peuvent fournir des indices importants sur la biologie de la rétine dans son ensemble, mais il est difficile de discerner les contributions individuelles de types de cellules touchées par maladie. Imagerie des tissus rétiniens isolés ex vivo permet de contourner ces problèmes et tandis qu’imaging plate montés rétines offre une vue sur la rétine externe13, plus profonds intérieurs caractéristiques rétiniennes sont obscurcies. Tranches de rétinal transversal, telles que celles présentées dans fixe des analyses immunohistochimiques, permettent une vision claire de tous les calques et les types de cellules mais seulement offrent un aperçu unique des processus dynamiques impliqués dans la maladie et de la fonction normale.
Nous présentons ici une méthode pour générer des ex vivo transversal rétinienne tranches de poisson-zèbre adulte pour l’imagerie. Il est similaire aux méthodes employées pour préparer des amphibiens et des poissons zèbres tranches rétiniennes pour14,des études électrophysiologiques et morphologiques15, avec des modifications importantes pour le laps de temps d’imagerie ex vivo utilisant confocal microscopie. Réponses de la fluorescence des biocapteurs ou colorants en tranches sont surveillés en temps réel avec un microscope confocal tout en livrant des agents pharmacologiques à l’aide de perfusion. Alors que la méthode a été développée pour l’imagerie des photorécepteurs, il peut être possible de l’utiliser pour visualiser les cellules Müller, cellules bipolaires, les cellules horizontales, les cellules amacrines ou cellules ganglionnaires rétiniennes avec des marqueurs fluorescents appropriés. En outre, tranches peuvent être chargés avec des colorants fluorescents perméable à la cellule de la viabilité cellulaire rapport, transport vésiculaire, la fonction mitochondriale ou état redox. Cette préparation polyvalente permet la visualisation d’un large éventail de processus subcellulaires tout au long de la rétine, y compris Ca2 + dynamique, transduction du signal et état métabolique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo imagerie rétinienne tranches de poisson zèbre fraîche s’est avéré pour être un outil polyvalent pour l’étude des photorécepteurs biologie20,21,22et est unique parce qu’il permet l’analyse des cellules individuelles dans un âge mûr, entièrement rétine différenciée. Avec la pratique, il est possible de réaliser des expériences multiples avec des tissus provenant d’un seul poisson, même e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Ralph Nelson et Daniel Possin d’orientation réfléchie tout en développant ce protocole, Eva Ma, Ashley George et Gail Stanton pour génération de lignes zebrafish transgénique stable. Le travaux ont été subventionnés par NSF GRFP 2013158531 de M.G., NIH NEI 5T32EY007031 aux W.C. et M.G. et EY026020 à J.H. et S.B.
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referências
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