إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب
Summary
التصوير نسيج الشبكية يمكن أن توفر معلومات الخلايا المفردة التي لا يمكن جمعها من الطرق الكيميائية الحيوية التقليدية. ويصف هذا البروتوكول إعداد الشرائح الشبكية من الزرد لتصوير [كنفوكل]. فلوري وراثيا ترميز أجهزة الاستشعار أو الأصباغ مؤشر يسمح التصور للعديد من العمليات البيولوجية في أنواع مختلفة من الخلايا الشبكية.
Abstract
شبكية العين هي نسيج معقد يبدأ ويدمج الخطوات الأولى للرؤية. الخلل الوظيفي للخلايا الشبكية سمة مميزة للكثير من الأمراض المسببة للعمى، والعلاجات المستقبل يتوقف على التفاهمات الأساسية حول كيفية مختلفة الشبكية خلايا تعمل بشكل طبيعي. قد ثبتت صعوبة الحصول على مثل هذه المعلومات مع أساليب الكيمياء الحيوية نظراً لأن هي تناقص المساهمات لأنواع معينة من الخلايا في الوسط الخلية الشبكية. تصوير الشبكية حية يمكن أن توفر طريقة عرض للعديد من العمليات البيولوجية على المستوى سوبسيلولار، بفضل عدد متزايد من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة. ومع ذلك، هذه التقنية كانت حتى الآن محدودة للضفادع الصغيرة واليرقات الزرد، طبقات الشبكية الأبعد من شبكية العين المعزولة، أو تصوير القرار أقل من شبكية العين في الحيوانات الحية. هنا نقدم طريقة لتوليد يعيش السابقين فيفو الشرائح الشبكية من الزرد الكبار لتصوير مباشر عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. هذا الإعداد غلة شرائح عرضية مع جميع طبقات الشبكية، ومعظم أنواع الخلايا المرئية لأداء تجارب التصوير [كنفوكل] استخدام التروية. إذ تعرب عن بروتينات الفلورسنت الزرد المحورة وراثيا أو أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في أنواع محددة من الخلايا الشبكية أو العضيات تستخدم لاستخراج المعلومات خلية واحدة من شبكية سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح الشبكية مع الأصباغ الفلورية المؤشر، إضافة إلى براعة في الأسلوب. تم تطوير هذا البروتوكول للتصوير Ca2 + داخل photoreceptors مخروط الزرد، ولكن بعلامات مناسبة فإنه يمكن تكييفها لقياس Ca2 + أو نواتج الأيض في الخلايا أو الخلايا الأفقية والقطبين، microglia، الخلايا أماكريني أو الشبكية مولر خلايا العقدة. تتم إزالة ظهارة صباغ الشبكية من شرائح حتى هذه الطريقة ليست مناسبة لدراسة هذا النوع من الخلايا. مع الممارسة، من الممكن لإنشاء شرائح المسلسل من الحيوان واحدة لتجارب متعددة. يوفر هذا الأسلوب يمكن تكييفها أداة قوية للرد على العديد من الأسئلة حول بيولوجيا الخلايا الشبكية، Ca2 +والتوازن الطاقة.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) أصبحت تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية الطبية والأساسية1، نظراً لصغر حجمه، والتطور السريع ونظم الجهاز الفقاريات. الشفافية الطبيعية يرقات الزرد جنبا إلى جنب مع الأساليب المتبعة ترانسجينيسيس مكنت التصور تفصيلية للعمليات الخلوية في الحيوانات حية. استهدفت عددا من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية الفلورسنت وراثيا المرمزة إلى خلايا محددة الزرد للكشف عن Ca2 + 2، وفوق أكسيد الهيدروجين3، أبوبتوتيك التنشيط4 و ATP5.
في فيفو تصوير يرقات الزرد أدى إلى اختراقات في مجال علم الأعصاب، بما في ذلك رسم خرائط للدماغ الدوائر6 وتطوير العقاقير للجهاز العصبي المركزي واضطرابات7. الزرد أيضا مناسبة للرؤية للبحث نظراً لأن ميزة شبكية العين على بنية طبقية وأنواع الخلايا العصبية للفقاريات العليا، وأنها عرض السلوكيات بصرية قوية8،9. تم بنجاح على غرار عدة أنواع من تنكسات الشبكية مماثلة للأمراض البشرية ودرس في الزرد10،11، بما في ذلك التصوير الحي من photoreceptors حدة التدهور داخل شبكية2، 12.
بينما في فيفو تصوير الزرد اليرقات أداة قيمة، فإنه يصبح أكثر صعوبة كما الأسماك تنمو وتتطور تصبغ، وبعض العلاجات الدوائية لا تتخلل حيوان كامل. علاوة على ذلك، تغيير بعض العمليات الخلوية مع التنمية، والعمر، مما يجعل لاحق الوقت النقاط الحرجة للدالة التفاهم وتطور المرض في الحيوانات الكبار. أساليب الكيمياء الحيوية مثل إيمونوبلوت، كوانتيتياتيفي بكر واستهلاك2 س وتحليلات metabolomic يمكن أن توفر أدلة هامة حول علم الأحياء الشبكية ككل، ولكن من الصعب أن نتبين إسهامات أنواع الخلايا الفردية تتأثر المرض. التصوير نسيج الشبكية معزولة السابقين فيفو يتجاوز هذه القضايا، وحين التصوير شقة المحملة شبكية العين يتيح عرض شبكية العين الخارجي13، يتم حجب ميزات الشبكية الداخلية أعمق. شرائح عرضية الشبكية، مثل تلك التي قدمت في ثابت تحليلات المناعي، تمكين رؤية واضحة لجميع الطبقات وأنواع الخلايا ولكن لا تقدم سوى لقطة واحدة من العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها وظيفة طبيعية والمرض.
نقدم هنا، وسيلة لتوليد السابقين فيفو عرضية الشرائح الشبكية من الزرد الكبار للتصوير. ومشابه لأساليب لإعداد الشرائح الشبكية البرمائية والزرد للدراسات الكهربية والمورفولوجية14،15، مع تعديلات هامة للفاصل الزمني التصوير السابقين فيفو استخدام [كنفوكل] الفحص المجهري. وتراقب الردود الأسفار من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو الصبغات في شرائح في الوقت الحقيقي مع مجهر [كنفوكل] بينما كان يلقي وكلاء الدوائية باستخدام التروية. بينما وضعت الطريقة للتصوير فوتوريسيبتورس، قد يكون من الممكن استخدامها لتصور الخلايا أو الخلايا ثنائية القطب، أفقي من الخلايا، الخلايا أماكريني أو خلايا الشبكية العقدة مولر مع علامات مضيئة مناسبة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحميل الشرائح مع الفلورية الأصباغ نفاذية الخلية لتقرير جدوى الخلية أو النقل حويصلية، الوظيفة المتقدرية أو حالة الأكسدة والاختزال. يسمح هذا الإعداد تنوعاً تصور طائفة واسعة من العمليات سوبسيلولار في جميع أنحاء الشبكية، بما في ذلك Ca2 + ديناميات وتوصيل الإشارة والدولة الأيضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
السابقين فيفو تصوير الشرائح الشبكية الزرد الطازجة وقد ثبت أن تكون أداة متعددة الاستخدامات لدراسة علم الأحياء20،،من2122، وهي فريدة من نوعها في ذلك فإنه يمكن تحليل الخلايا المفردة في ناضجة، تماما الشبكية المتباينة. مع الممارسة، من المم…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر رالف نيلسون ودانيال بوثين لتوجيه مدروس أثناء وضع هذا البروتوكول، وايفا Ma وجورج أشلي ستانتون غيل لتوليد خطوط الزرد المعدلة وراثيا مستقرة. وأيده العمل جبهة الخلاص الوطني جرفب 2013158531 للشخص، 5T32EY007031 نيي المعاهد الوطنية للصحة للمراحيض والشخص، و EY026020 إلى J.H. ونشره
Materials
| zebrafish | Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility | stocks maintained in-house as stable transgenic lines | |
| petroleum jelly | Fisher Scientific | 19-090-843 | for petroleum jelly syringe |
| 3-mL slip tip syringe | Fisher Scientific | 14-823-436 | for petroleum jelly syringe |
| 20g 3.8 cm slip tip needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | for petroleum jelly syringe |
| plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for eyecup dissection, slicing chamber |
| Seche Vite clear nail polish | Amazon | B00150LT40 | for slicing chamber |
| 18 mm X 18 mm #1 glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | for imaging ladders |
| unflavored dental wax | Amazon | B01K8WNL5A | for imaging ladders |
| double edge razor blades | Stoelting | 51427 | for tissue slicing |
| tissue slicer with digital micrometer | Stoelting | 51415 | for tissue slicing |
| filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size | EMD Millipore | HAWG01300 | filter paper for mounting retinas |
| 10 cm petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly |
| 15 cm plain-tipped wood applicator stick | Fisher Scientific | 23-400-112 | for wire eye loop tool |
| 30g (0.25 mm diameter) tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | for wire eye loop tool |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G8270 | component of supplement stock solution |
| sodium L-lactate | Sigma Aldrich | L7022 | component of supplement stock solution |
| sodium pyruvate | Sigma Aldrich | P2256 | component of supplement stock solution |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | component of supplement stock solution |
| L-glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G4251 | component of supplement stock solution |
| L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A5960 | component of supplement stock solution |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | component of Ringer's solution |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | component of Ringer's solution |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | component of Ringer's solution |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | component of Ringer's solution |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | component of Ringer's solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | component of Ringer's solution |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | component of Na+-free Ringer's solution |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | component of Na+-free Ringer's solution |
| 50 mL conical centrifuge tube | Denville Scientific | C1062-P | container for Ringer's solution |
| Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades | World Precision Instruments | 501790 | micro-scissors for eyecup dissection |
| Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips | World Precision Instruments | 504510 | fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation |
| single edge razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | for eyecup dissection and trimming filter paper |
| EMD Millipore filter forceps | Fisher Scientific | XX6200006P | flat forceps for handling wet filter paper |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature |
| propidium iodide (PI) | Fisher Scientific | P3566 | stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature |
| Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature |
| tissue perfusion chamber | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | imaging chamber for injection or perfusion |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) | Fisher Scientific | N13195 | fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia |
| Olympus laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution |
| Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM |
| miniature aspirator positioner | Cell MicroControls | FL-1 | for perfusion |
| perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder | Warner Instruments | various | for perfusion |
Referências
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Andrews, N., et al. Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time. J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).
- Kioka, H., et al. Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception. Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).
- Zou, S. -. Q., Yin, W., Zhang, M. -. J., Hu, C. -. R., Huang, Y. -. B., Hu, B. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J. Vis. Exp. (36), e1742 (2010).
- Neuhauss, S. Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish. J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).
- Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).
- Gross, J., Perkins, B. Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans. Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).
- Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration. J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).
- Wang, T. -. M., Holzhausen, L., Kramer, R. Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina. Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).
- Van Hook, M., Thoreson, W. Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation. J. Vis. Exp. (76), e50007 (2013).
- Connaughton, V. Zebrafish retinal slice preparation. Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).
- Kennedy, B., et al. Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).
- George, A., et al. Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments. PLoS ONE. 9 (1), e84394 (2014).
- Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases. Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).
- Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , (2015).
- Kanow, M., et al. Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye. eLife. 6, (2017).
- Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors. J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).
- Uckermann, O., et al. Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts. Glia. 45 (1), 59-66 (2003).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (99), (2015).
