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Biologia do Desenvolvimento

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Published: December 18, 2017
doi:
10.3791/56960
, , , ,
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology,University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease,University of Michigan

Summary

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Abstract

Avances dans la culture 3D des tissus intestinaux obtenus par biopsie ou générés à partir des cellules souches pluripotentes par différenciation dirigée, ont abouti à des modèles sophistiqués en vitro de la muqueuse intestinale. S’appuyant sur ces systèmes modèles émergents nécessitera l’adaptation d’outils et de techniques mises au point pour les animaux et les systèmes de culture 2D. Nous décrivons ici une technique pour mesurer la perméabilité de la barrière épithéliale dans une organoïdes intestinale humaine en temps réel. Ceci est accompli par microinjection de dextran fluorescent marqué et d’imagerie sur un microscope inversé muni de filtres épifluorescence. Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière en organoïdes intestinale facilite la génération de données temporelles à haute résolution dans le tissu épithélial intestinal humain, bien que cette technique peut également être appliquée à fixe validant des approches d’imagerie. Ce protocole est facilement adaptable pour la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale après une exposition à des agents pharmacologiques, des produits bactériens ou des toxines ou des micro-organismes vivants. Avec des modifications mineures, ce protocole peut servir aussi comme une amorce générale sur la microinjection d’organoïdes intestinale et utilisateurs peuvent souhaiter compléter ce protocole avec supplémentaires ou autres applications en aval après microinjection.

Introduction

L’épithélium intestinal constitue une barrière sélective qui intervient dans le transport directionnel de nutriments, H2O, des ions et des déchets produits tout en minimisant les non-spécifique échange induite par la diffusion d’autres particules entre la lumière et la mésenchymateuse tissu ou sang d’alimentation1,2. La perméabilité non spécifique de la barrière épithéliale intestinale a longtemps été considéré comme un paramètre clé fonctionnel à la fois la santé et la maladie3,4,5,6, qui reflète le taux de diffusion de petites molécules à travers l’épithélium via l’espace paracellulaire. Mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale peut être effectuée en7 de modèles animaux et des patients humains8 par l’ingestion de lactulose, qui n’a aucun transporteur spécifique dans le tractus gastro-intestinal et la collecte ultérieure et la mesure des concentrations de lactulose dans le sang périphérique. Les marqueurs ingérés remplaçant de la fonction de barrière comme glucides fluorescent étiquetés sont également disponibles9,10. Cette approche a été adaptée pour les cultures de cellules épithéliales intestinales sur Transwell appuie11, une approche simplifiée qui permet un meilleur contrôle expérimental mais a aussi été critiquée comme un mauvais prédicteur de in vivo perméabilité en raison de l’absence de différenciation épithéliales sous-types et tissu structure12. Moyen de chambres représentent encore une autre approche et permettent la mesure de la fonction de barrière épithéliale muqueuse intestinale ensemble ex vivo13. Application de cette technique est souvent limitée par tissu disponibilité et condition13,14. Ainsi les nouvelles méthodes qui équilibre la reproductibilité et le débit avec pertinence physiologique sont nécessaires.

Développements récents en in vitro de l’organogenèse ont conduit à l’adoption de systèmes de modèles 3D de vitroplants dans une plateforme sophistiquée pour récapitulant la dynamique complexe de tissus15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. En particulier, humains ou les cellules souches (hPSC) dérivé organoïdes intestinale humaine (HIOs)19,24 ont émergé comme un système modèle reproductible et expérimentalement tractable pour l’étude des interactions hôte-microbienne et barrière épithéliale dynamique25,26,27,28. De même, humaine dérivée de tissu organoïdes (également connu sous le nom enteroids) peuvent être dérivés d’une procédure de biopsie simple et utilisable comme un système souple d’étudier la physiologie humaine et la maladie15,29,30. La microinjection d’organoïdes intestinale humaine permet la prestation de composés expérimentaux25 ou vivre des microbes25,31,32,33 à l’apicale épithéliales surface de la lumière organoïde. Leslie et Huang et al. 25 a récemment adapté cette technique pour mesurer la perméabilité de la barrière à HIOs micro avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) étiqueté dextran après une exposition à des toxines bactériennes.

Ce protocole se veut un guide pour la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale en HIOs dérivés hPSC et HIOs dérivé de tissu par microscopie fluorescente. Avec des modifications mineures, il peut également servir une amorce générale sur microinjection de HIOs avec composés expérimentaux. Les utilisateurs peuvent compléter ce protocole avec supplémentaires ou autres applications en aval après microinjection.

Protocol

Normal, dépersonnalisées tissus intestinaux adultes humains proviennent de donneurs d’organes décédée à travers le don de vie, Michigan. Lignée H9 de cellules ES humaines (registre de NIH #0062) a été obtenue du WiCell Research Institute. Tous les tissus humains utilisés dans cet ouvrage proviennent de donneurs non vivants, a été rendus anonymes et a été menée avec l’approbation de l’IRB de l’Université du Michigan (protocole # HUM00093465 et HUM00105750). 1. microinjector le programme d’installation Obtenir les matériaux énumérés dans la Table des matières. Placez le micromanipulateur, dissection étendue et source lumineuse dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Nettoyer l’installation de microinjection avec l’éthanol à 70 % ou un autre désinfectant avant utilisation expérimentale. Éviter l’exposition prolongée aux désinfectants contenant l’eau de Javel, ce qui pourrait endommager l’équipement de microinjection.Remarque : Un exemple d’un ensemble complet de microinjector est illustré dans la Figure 1. Positionner la dissection étendue de sorte que l’oculaire peut être utilisé par l’orifice d’accès dans le bouclier pour la biosécurité du cabinet. Alternativement, utilisez un banc propre avec système de flux d’air positif en lieu et place d’une armoire avec points d’accès de microscope de biosécurité. Assembler le micromanipulateur sur le côté droit du microscope selon les instructions du fabricant et ajuster pour que les commandes peuvent être facilement atteint et ajustés. Le micromanipulateur doit être monté sur une plaque de fer ou stabiliser.Remarque : Les utilisateurs gauchers pouvez placer le micromanipulateur à gauche de l’étendue de la dissection. Fixer le support d’une micropipette au bras micromanipulateur et raccordez le tuyau analogique en l’insérant dans le titulaire de la micropipette. Remplir la seringue de verre de 10 mL avec environ 5-7 mL d’huile minérale stérile. Connecter la seringue 10 mL en verre remplie d’huile minérale à l’extrémité ouverte du tube analogique en utilisant le mécanisme de verrouillage Luer. Placer la seringue en verre à gauche de la portée de dissection, en face du micromanipulateur. Appuyer légèrement sur la seringue, poussant l’huile minérale dans la tubulure. Rincer environ 10 gouttes d’huile minérale de la pointe du titulaire une micropipette et s’accumuler dans une boîte de Pétri ou autre embarcation semblable et jeter.Remarque : Cette étape supprime tout l’air du circuit respiratoire et doit être effectuée avant chaque séance de microinjection. 2. préparation de microinjection 24h avant microinjection : Préparer FITC dextran solution suspend re-dextran FITC à une concentration de 2 mg/mL de PBS stérile ou de sérum physiologique. Préparer un volume total de > 250 µL.Remarque : Des concentrations plues ou moins élevées de FITC-dextran peuvent être utilisées, allant d’environ 0,1 – 10 mg/mL. Ajuster la concentration du FITC-dextran pour répondre à la demande d’imagerie en aval. Installation organoïde cultures sur lames chambre de 4 ou 8 puits verre ou autre récipient de culture adapté pour accommoder jusqu’à microscopie, 4-6 HIOs / puits, incorporé dans 50 µL de solution de matrice cellulaire et cultivés dans un facteur de croissance de la FEM, caboche et R-Spondin (ENR) médias 19 ,24. Prendre soin d’espacer les organoïdes uniformément (distantes d’environ 5 mm) pour éviter la capture HIOs multiples dans un seul champ microscopique pendant l’analyse d’imagerie en temps réel. Pour un guide complet de HIO, la culture et l’entretien voir McCraken et al. 24.Remarque : Ce protocole a été développé à l’aide de cellules souches dérivées HIOs et les résultats représentatifs (voir ci-dessous) montrent l’utilisation de ce modèle de culture de tissus. Cependant, le même protocole est facilement adapté au dérivé de tissu intestinal épithéliales organoïdes15,29. HIOs dérivés de tissus sont généralement plus petits que dérivé de CFP HIOs et manque l’appui basolatérale mésenchymateuses cellule structure15,29,30. Microinjection de HIOs dérivés de tissus peut exiger un degré élevé de technicité et expérience. On ne connaît pas le degré auquel barrière épithéliale perméabilité obtenue à l’aide de tissus dérivés HIOs peut corrélées avec HIOs dérivées de hPSC. Incuber HIOs dans un incubateur de culture cellulaire standard à 42 ° C et 5 % de CO2 avant microinjection. 30 minutes avant microinjection, tourner sur la biosécurité du cabinet et soulever le bouclier de verre à la hauteur de travail optimale. Retirez tous les éléments inutiles de la biosécurité du cabinet. Encombrement augmente le risque de déversements ou d’autres accidents lorsque travaillant dans des espaces confinés. Vaporiser et nettoyer soigneusement la surface de travail avec l’éthanol à 70 % ou un autre désinfectant. Essuyer à l’aide d’une serviette en papier. Vérifiez le niveau d’huile minérale dans la seringue en verre attachée à la microinjector. S’il y a moins de 3 mL d’huile minérale restante, dévissez la seringue et remplir à l’intérieur de l’armoire, en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles de biosécurité. Ne pas remplir plus de 7 mL. Allumer la lampe pour éclairer la portée de dissection. Régler l’oculaire pour confort personnel. Positionner le micromanipulateur à droite de l’étendue de la dissection. Fixez le micromanipulateur à une plaque de fer à l’aide d’un support magnétique. Placez-vous dans la position OFF pour régler la position de la micromanipulateur et garantir le support pour la plaque de fer en définissant le support magnétique en position le support magnétique. Microcapillaire installation Récupérez un filament de verre unique de 1 mm dans le conteneur de stockage fourni par le fabricant. Insérer le filament de verre à travers le centre de la bobine de cuivre de chauffage de la micropipettes.Remarque : Voir la Figure 2 pour un guide pour la préparation des micropipettes. Positionner le filament pour que la bobine de cuivre de chauffage soit environ au milieu du filament de verre. Cela garantira que l’extracteur génère deux aiguilles de microinjection utilisable chaque filament de verre. Fixez le filament de verre avec les pinces en serrant le haut serre-tout d’abord, en vous assurant que le filament de verre est fixé dans le bosquet cranté pour éviter tout bris. Étendre le bras arrache à sa position verticale maximale avant de serrer la bride inférieure.Remarque : Cette étape est essentielle. Ouvrir complètement le bras extracteur entraînera une séparation irrégulière des deux sections du filament verre. Vérifiez les paramètres sur le chauffage et le mécanisme de traction.Choisir chauffage #1 avec la bascule (990) et la valeur PULL à 059 (Figure 2). Allumez l’instrument à l’aide de la touche On/Off. Fermez le bouclier de protection plexiglass et appuyez sur le bouton tirer sur la face inférieure de droit de l’extracteur. La bobine de cuivre commence à chauffer et s’allume en orange vif. Lorsque la température augmente, le filament de verre commencera à s’étirer et séparer par la suite. Moment de la séparation des deux extrémités du filament verre, l’appareil s’éteindra.Remarque : Le rouleau de cuivre reste extrêmement chaud pendant plusieurs minutes. Le filament de verre tiré sera considérée comme une « microcapillaire » à partir de ce moment dans le protocole. En prenant soin de ne pas toucher la bobine de cuivre, de démonter un autre de la microcapillaries de verre. Le microcapillaire devrait avoir une pointe très fine. Gérez la microcapillaire soigneusement avec des gants en latex ou nitrile et procéder immédiatement à l’armoire de biosécurité contenant le programme d’installation microinjector.Remarque : Le verre microcapillaire est extrêmement forte et très fragile. Manipuler avec précaution. Dévissez le capuchon d’extrémité du bras micromanipulateur. Insérez l’extrémité arrondie de la microcapillaire tiré dans l’extrémité ouverte du titulaire une micropipette et poussez-le vers l’intérieur jusqu’à ce qu’elle s’arrête. Fixez l’extrémité arrondie de la microcapillaire au bras micromanipulateur en resserrant le capuchon d’extrémité.Remarque : Lorsque vous installez le microcapillaire sur le système de micro-injection prendre soin de ne pas toucher l’extrémité affûtée. Cela réduire les risques de contamination et conserver la pointe fine de microinjection. Défaut de sécuriser correctement le microcapillaire pouvant provoquer l’instabilité ou la rupture du filament verre lors microinjection. Ouvrir l’extrémité de la microcapillaire de verre. Au cours de la préparation de la microcapillaire verre tiré, la pointe du point fondra probablement de façon à sceller l’extrémité pointue de la microcapillaire. Pour supprimer ce blocage : Placez le micromanipulateur de telle sorte que le microcapillaire est pointé vers le bas à l’étape de verre de la dissection étendue sans toucher à cette surface. Trouver une surface plastique stérile (le dessous d’un couvercle de plaque de culture fonctionne parfaitement) et placez-le sur la platine du microscope directement sous l’aiguille microcapillaire sur la scène de l’étendue de la dissection. Centrez l’extrémité de la microcapillaire sous la zone d’affichage et s’assurer qu’elle est visible quand on regarde à travers l’oculaire du microscope moins 1,5 grossissement X. En utilisant les contrôles micromanipulateur, avancer lentement le bras micromanipulateur et microcapillaire vers le couvercle de culture en plastique stérile jusqu’à ce que la pointe touche à peine la surface en plastique et la pointe de la microcapillaire se libère.NOTE : Viser la plus petite pause possible qui permet un écoulement fluid le filament de verre afin de minimiser les dommages subis par le HIO lors de microinjection. Retour le microcapillaire loin de la surface stérile pour minimiser le risque de rupture accidentelle avant de continuer. Vérifier le microcapillaire pour l’écoulement en appuyant sur la seringue en verre, poussant l’huile minérale dans la tubulure. Si la fin de la microcapillaire a été ouvert, vous verrez une petite goutte d’huile minérale émergent de la pointe de la microcapillaire après quelques secondes. Si cela ne fonctionne pas, répétez l’étape précédente puis refaire le test. 3. stérile Microinjection Remarque : Une fois le microcapillaire a été préparé, installé et testé, commencer HIOs microinjecting. La figure 3 illustre un dérivé de tissus HIO qui a été injecté avec succès avec FITC-dextran. Remplir le microcapillaire avec le matériel d’injection. Plonger l’extrémité de la microcapillaire de verre dans la suspension injectable du dextran FITC, en prenant soin d’éviter de casser la pointe de la microcapillaire contre les côtés ou le fond du tube. Une fois que la pointe de la microcapillaire est immergée dans la solution, tirez sur la seringue d’huile minérale pour attirer environ 10 µL de la suspension de dextran FITC dans le microcapillaire.Remarque : Il est recommandé d’utiliser des tubes de 1,5 mL ou 0,5 mL pour l’injection des solutions/cultures puisque ceux-ci seront le plus facilement accessible à la microcapillaire installé. Alternativement, injection des solutions peuvent être tirées d’une boîte de Petri stérile ou parafilm stérile, ce qui peut réduire le risque de blessure pour objets tranchants en limitant la nécessité de tenir un tube à proximité de la microcapillaire. Si la suspension est très visqueuse ou si l’ouverture de la microcapillaire est exceptionnellement petit, il peut prendre plusieurs secondes pour remplir le microcapillaire. Ne pas prendre des suspensions de microinjection dans le tube en plastique de microinjection comme ceci peut-être contaminer le système entier de microinjection. Arrêter le microcapillaire de remplissage lorsque la suspension de microinjection remplit 90 % de la longueur de la microcapillaire de verre. Appuyer légèrement sur la seringue avant de se retirer de la microcapillaire de la solution de microinjection pour assurer que la pointe de la microcapillaire ne contient-elle pas de poches d’air.Remarque : Si l’examen de la microcapillaire révèle des poches d’air, vider et remplir de nouveau. Retirer la plaque (s) culture HIO de l’incubateur de culture cellulaire et le transfert à la biosécurité du cabinet avec le microinjector. Enlever le couvercle de la plaque de culture HIO au sein de la biosécurité du cabinet et centrez le premier puits sur la platine du microscope pour qu’il soit clairement visible à travers l’oculaire de la lunette vers le paramètre d’agrandissement le plus bas. Tourner le bras micromanipulateur telle que la microcapillaire est pointé vers le bas dans la culture HIO bien à un angle > 45° par rapport à la platine du microscope. C’est plus facilement réalisable en tournant manuellement l’assemblage du bras micromanipulateur sur son axe horizontal du point où le soutien du bras horizontal micromanipulateur croise le support vertical, étant donné que les contrôles fines (cadrans noirs) ont un nombre limité de Motion. Positionner la pointe de la microcapillaire au-dessus de la première culture bien à environ 1 cm au-dessus de la surface des médias (Figure 3 a). Une image représentative démontrant la microinjection d’organoïdes épithéliale intestinale dérivée de tissu est montrée dans la Figure 3 b. Vérifiez que les deux le bout du filament de verre et les HIO(s) sont visibles à travers l’oculaire. Repositionner si nécessaire. Faire progresser la microcapillaire lentement en tournant le bouton de commande d’axe z dans le sens horaire.Remarque : Juger la position de l’extrémité microcapillaire, en particulier la profondeur, nécessite pratique. Lorsque la pointe contraire à la surface des médias, vous remarquerez une légère distorsion visuelle de la pointe microcapillaire.Procéder avec prudence, de ce point pour éviter de casser la microcapillaire contre le fond de la plaque de culture ou d’endommager les HIOs. Percer le HIO avec la pointe microcapillaire. La surface extérieure de la HIO va enfoncer légèrement comme le microcapillaire commence à appliquer une pression et sautera, remise en forme, comme la pointe pénètre la lumière. Il peut être difficile d’identifier la pointe de la microcapillaire dans la lumière HIO. Ajustez les paramètres d’éclairage ou de grossissement de l’étendue de la dissection s’il est difficile de voir la microcapillaire. Enlever les mains des contrôles micromanipulateur lorsque le microcapillaire est correctement positionné avec la pointe de la microcapillaire près du centre de la HIO. Appuyer sur la seringue d’huile minérale légèrement pour pousser la solution de microinjection hors la microcapillaire et dans le lumen HIO. Le HIO peut augmenter légèrement pour tenir compte du volume de l’injection.Remarque : veiller à ne pas trop remplir le HIO, car cela provoquerait l’organoïde éclater. Comme règle générale, toute expansion visible du volume HIO signifie qu’il est temps d’arrêter. Le volume moyen de la lumière HIO mature est environ de 1 µL, mais peut varier considérablement. Automated seringue pompes peuvent être utilisées à la place une seringue manuelle afin de permettre un contrôle précis du volume injecté. Retirer le microcapillaire le HIO en utilisant le contrôle de l’axe z et la position au-dessus de la surface des médias. Passer à la prochaine cible HIO avec le microcapillaire placée au-dessus des médias pour éviter les dommages accidentels aux HIOs lors de manœuvres et injecter de manière similaire (voir étapes 3.6-3.11). Remplissez le microcapillaire utilisant l’approche décrite ci-dessus.Remarque : Si la pointe tombe à tout moment au cours de la microinjection, n’essayez pas de poursuivre les injections. Changer le cône suivant les instructions ci-dessous. Changer le microcapillaire entre les traitements ou en cas de rupture. Desserrer le collier sur l’extrémité du bras micromanipulateur et retirer le microcapillaire du titulaire de la micropipette.ATTENTION : Ne pas manipuler la microcapillaire près de l’extrémité pointue. La fine pointe de la microcapillaire est extrêmement forte et sera facilement perforer de gants et la peau. Faites attention et soyez conscient de tous les mouvements, gérant la microcapillaire utilisant le manipulateur seulement et ne jamais mettre les mains entre le point de la microcapillaire et les cultures HIO. Chercher un traitement médical immédiatement dans le cas d’une piqûre d’aiguille accidentelle d’un microcapillaire contenant des agents infectieux ou des toxines.Remarque : Dans certains cas, il peut être difficile de confirmer visuellement réussie microinjection de HIO. La visibilité des suspensions de microinjection clair peut être améliorée par l’utilisation de l’addition des concentrations plus élevées de FITC-dextran. 4. traitement des HIOs Pour tester les composés livrés à l’épithélium apicale, remettre en suspension dans du PBS stérile contenant 2 mg/mL FITC-dextran et microinject dans la lumière HIO comme indiqué ci-dessus (Section 3). Pour l’expérience représentative, resuspendre toxine de Clostridium difficile TcdA à 12,8 ng/µL dans du PBS contenant FITC-dextran. Pour tester les composés livrés au compartiment basolatérale, remplacer le support externe de culture avec les nouveaux médias contenant 2 mM ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tétraacétique (EGTA)(positive control), véhicule de PBS seul (témoin négatif ), ou tout autre composé expérimental après microinjection de FITC-dextran.Remarque : Le dosage et le moment de l’application des composés pharmacologiques, toxines ou d’autres agents peuvent varier selon la question expérimentale. 5. vivre d’imagerie de micro-injection organoïdes BEGIN vivent d’imagerie microinjection immédiatement après. Transférer les plaques de culture à un microscope à fluorescence équipé d’une chambre humidifiée maintenue à 37 ° C et 21 % O2 et 5 % de CO2 avec un système d’imagerie de cellules vivantes automatisé. Fermer la chambre environnementale et démarrer le processus d’imagerie. Lancer le logiciel d’analyse de l’image (par exemple, softWoRx) à partir du bureau. Cliquez sur « Fichier » et sélectionnez « Acquire (Resolve 3D) » pour initialiser l’imagerie et le logiciel de contrôle de microscope. La valeur excitation/émission FITC (475 nm excitation/523 nm des émissions), régler la puissance de transmission à 5 % et la lentille à 4 X. Définir la durée d’exposition à 0,025 ms (Figure 4 a).Remarque : La durée d’exposition devrait être modifiée en fonction de la puissance du signal fluorescent. En général, le signal de fluorescence FITC diminuera seulement. Par conséquent, pour assurer une sensibilité maximale, les temps d’exposition initiale doivent être ajustées tel que le signal fluorescent enregistré est juste en dessous du point de saturation de la caméra et le logiciel d’imagerie. Trouver les HIOs grossissement de 4 X en utilisant le contrôleur numérique attaché au microscope. Centrez le HIO dans la visualisation du champ (Figure 4 a). Cliquez sur « Affichage » dans la barre d’outils, puis sélectionnez « Liste de Point » pour révéler une nouvelle fenêtre. Cliquez sur « Marquer des points » pour stocker la position actuelle de la scène dans la liste de points (Figure 4 a). Répétez les étapes 5.4 et 5.5 jusqu’à ce que les positions de tous les HIOs ont été enregistrées. En utilisant un bloc-notes ou un enregistrement numérique, notez le numéro d’identification unique attribué à chaque position de microscopie programmée et les images captées à cette position. Les fichiers de l’image seront balisés avec ce numéro d’identification et il sera important d’associer les matricules image HIOs et traitements spécifiques après que collecte des données est terminée. Pour installer la collection d’images automatisée, cliquez sur « Fichier », puis « Expérience » dans la barre d’outils. Nom de l’expérience avec la date ou un autre nom unique. Définir les paramètres de la collection d’images en passant par chacun des onglets option comme le montre la Figure 4 b. Décochez « Z sectionnement » sous l’onglet « Découpe ». Sous l’onglet « Canaux », entrez les paramètres dans la fenêtre supérieure gauche « 3D de résoudre ». Pour gagner du temps, la première ligne sera automatiquement rempli lorsque la case à gauche sur cochée. Sous l’onglet « Time-lapse », cochez la case intitulée « Time lapse » et entrez l’intervalle de temps entre les images dans la ligne intitulée « Time-lapse » et la durée totale de l’expérience dans la ligne intitulée « Temps Total ». Le logiciel calculera automatiquement le nombre de points dans le temps. Sous l’onglet « Points », cochez la case intitulée « Liste des Point de visite ».Vous pouvez également entrer manuellement le nombre de points déterminés à inclure dans l’expérience en tapant dans la zone de texte. Ne modifiez pas les options par défaut sous les onglets « Panneaux » ou « Actions ». Cliquez sur l’onglet « Run » entrez la date de l’expérience dans la zone étiquetée « nom du fichier image » et définissez les données enregistrer le lieu sous « Paramètres ». Cliquez sur la flèche verte pour exécuter la macro de l’expérience. Un compteur de laps de temps permettra de suivre l’évolution expérimentale. À la fin du cours de l’heure prévue, exporter et sauvegarder tous les fichiers image sous forme d’images TIFF RGB 24 bits (Figure 4). Dans la barre d’outils, sélectionnez le processus suivi par le constructeur de la tâche. Dans le menu générateur de tâche, ajouter des fichiers en naviguant vers le dossier de données spécifié à 5,9. Mettre en surbrillance tous les fichiers se terminant par « .dv » en tapant « *.dv » dans l’invite de commandes. Sélectionnez tout (Ctrl + A) et cliquez sur « Ajouter ». Cliquez sur + en vertu de la section intitulée « Tâche ». Sélectionnez « Exporter sous… » et cliquez sur l’onglet « Options ». Définir « Format d’exportation » pour « Images TIFF » et cochez la case ci-dessous pour ajouter un « dossier de sortie personnalisé ». Il s’agit de l’emplacement où les images TIFF seront exportés. Sélectionnez 24 bits RGB sous « Type de sortie TIFF » et cliquez sur « Terminé ». Cliquez sur « Soumettre à Queue » pour exécuter la Macro à l’exportation. Copiez les images TIFF exportés en 5.11 à un pilote externe ou un serveur si vous exécuterez l’imagerie après analyse (Section 6) sur un autre ordinateur.NOTE : Le tissu HIO et les médias peuvent être conservés pour histologie34,35de la PCR), Western blot,36, ou toute autre analyse en aval. 6. l’imagerie après analyse Assurez-vous que ImageJ37 est installé et fonctionne correctement sur l’ordinateur à utiliser pour l’analyse.NOTE : Fidji37 est une distribution alternative du programme de base d’ImageJ qui fonctionnera aussi bien pour cette analyse. Commencer l’analyse de lots en sélectionnant « Processus » puis « Lot » et enfin « Macro » dans le menu de ImageJ. Régler l’entrée sur le répertoire contenant les images TIFF, recueillies au cours de l’évolution expérimentale. Ouvrez le fichier « thesholdmeasure.ijm » de macro ImageJ ou directement copier/coller le code de macro dans la fenêtre. Cliquez sur « Process » pour commencer le traitement des fichiers.Remarque : Le seuil minimum valeur x (setThreshold(x,255);) peut être réglé sur n’importe quel nombre de 0 – 255 et doit être ajustée afin d’éliminer la fluorescence de fond. Valeurs < 100 sont recommandés. Pour empiriquement déterminer le seuil approprié, exécutez la macro d’imagerie sur une seule image représentant un organoïde avec aucun signal fluorescent. L’intensité moyenne de cette image peut servir de guide pour définir le seuil correctement. Dans l’analyse représentative présentée ci-dessous, le seuil était fixé à « 42 ». ImageJ produira une grande table contenant la zone de tous les pixels dans la plage d’intensité de seuil, et la moyenne, médiane, minimum et intensité maximale (limite) la valeur pour la zone dans les limites d’intensité de seuil. Enregistrer cette comme CSV ou XLS. Changement dans l’intensité au fil du temps peut être calculé dans une feuille de calcul39 en manipulant la table de données pour effectuer le calcul ci-dessous, ou peut être automatisé en utilisant un langage de programmation. Un exemple de script d’analyse rédigé dans R 40 est équipé de ce manuscrit.Remarque : Pour chaque HIO, intensité de la fluorescence relative peut être quantifiée comme . Élimination temps 41 (t1/2) du FITC-dextran dans le lumen HIO a été calculée comme suit : Tout d’abord, calculer le « aire sous la courbe » (AUC) de la courbe décrivant l’intensité de la fluorescence relative au fil du temps (t) comme : Puis, calculer la « clearance » () taux avec le volume de distribution (V,d) définie comme 1 pour la fluorescence normalisée à t = 0 : Définissez ensuite la « constante de vitesse d’élimination » () comme : Et enfin, calculer le temps de « l’élimination » (t1/2) comme : L’équation réduite est donc :

Representative Results

HIOs étaient différenciés de cellules souches pluripotentes humaines et mis en culture en solution à matrice cellulaire comme précédemment décrit19,24. Après 4 semaines de culture, les HIOs avaient élargi suffisamment pour permettre une microinjection. HIOs étaient micro avec 4 kDa conjugué FITC dextran suspendu dans PBS ou PBS contenant la toxine de Clostridium difficile TcdA. C. difficile est un pathogène opportuniste gastro-intestinal qui présente épithéliale toxicité induite par la toxine HIOs25. Comme témoin positif, EGTA a été ajouté pour les milieux de culture HIO dans un sous-ensemble de HIOs injecté avec PBS et FITC-dextran. EGTA est un chélateur du calcium qui provoque rapide la polymérisation de l’actine cytosquelette42. Fluorescence FITC a été suivie en temps réel sur un microscope d’imagerie live dans une chambre à environnement contrôlé et images ont été capturées dans des intervalles de 10 minutes. Analyse a posteriori des données d’imagerie a révélé des différences substantielles dans la rétention de la fluorescence FITC (Figure 5). HIOs injectés avec du PBS conservé la quasi-totalité du signal fluorescent à t = 0, bien qu’HIOs qui ont été injectés également avec TcdA des traités avec l’EGTA présentaient une diminution sensible de l’intensité de fluorescence par microinjection après 8 heures (Figure 5 a). données d’imagerie ont été quantifiées pour HIOs tous à tous moments générer un dataset haute résolution représentant la variation relative de l’intensité de fluorescence au fil du temps dans chacune des conditions expérimentales (Figure 5 b). Les différences de perméabilité épithéliale ont été évaluées en calculant la durée moyenne d’élimination (t1/2 ) du FITC pour chaque groupe de traitement (tableau 1) et en comparant les différences en t t1/2 entre les groupes à l’aide de l’élève t-test. HIOs témoins traités retenus la majorité des signaux fluorescent FITC pendant plus de 16 heures (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Traitement par EGTA considérablement réduit temps élimination FITC-dextran par rapport au témoin HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h ; P = 1,3 x 10-8). Conformément aux résultats déjà publiés25, microinjection de TcdA a considérablement augmenté perméabilité de la barrière épithéliale par rapport au traitement témoin (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h ; P = 5,4 x 10-4). Ainsi, aussi bien externes (EGTA) et microinjecté (TcdA) composés sont capables d’induire des changements significatifs dans la perméabilité de la barrière épithéliale à HIOs. Ces résultats suggèrent que les effets d’un large éventail d’agents pharmacologiques, métabolites, produits bactériens, cytokines, facteurs de croissance et d’autres composés sur la fonction barrière épithéliale peuvent être évaluées à l’aide de cette approche. Traitement Demi-vie (h) SEM (h) Bas 95 % IC (h) Haut 95 % IC (h) n Contrôle 17.11 0,3 16 h 45 17,78 11 EGTA 2,58 0,19 1,78 3.38 3 TcdA 7.56 0,63 5.93 9.18 6 Tableau 1 : élimination de temps moyen (t1/2) pour FITC-dextran à HIOs traités par EGTA ou TcdA. Les unités sont microinjection après heures. Figure 1 : agencement de base d’un microinjector et un micromanipulateur pour microinjection HIO. Cette image montre l’effectif complet de l’équipement utilisé pour l’exécution de microinjection de HIOs. Composantes clés sont étiquetés et informations de commande se trouvent dans la table des matières. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : micropipettes. Le cuivre chauffage bobine SC, bride supérieure c1, collier bas (c2), bras de l’extracteur (pa), activer/désactiver sélection de chaleur (ht) sont identifiés par les flèches. Le réglage correct pour 1 chaleur et PULL sont indiqués en rouge. L’encart montre un filament de verre correctement monté prêt pour le chauffage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : images représentatives d’une HIO dérivé de tissu injecté avec FITC-dextran. (A) Image de montrant le positionnement de la microcapillaire verre juste avant l’insertion dans le HIO et microinjection. (B) image de fond clair d’une organoïdes intestinale humaine dérivée de tissu après microinjection de FITC-dextran. Notez que le signal de fluorescence est apparent même sans l’utilisation d’un ensemble de filtres spécifique. Cette coloration facilite la précision de microinjection. Grossissement de X 3 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Live de flux de travail d’imagerie. (A) capture d’écran illustrant les étapes nécessaires pour définir les paramètres de microscope, trouver les HIOs sur la diapositive et enregistrer la position de l’étape pour chaque HIO être photographié. (B) les paramètres de l’imagerie pré pour capturer le canal FITC à intervalles réguliers à chacune des positions spécifiés dans exportation post-imagerie A. (C) des données au format DV fichiers sous forme d’images TIFF avec une image TIFF par HIO par point dans le temps.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : résultats représentatifs. (A) les cellules souches dérivées des organoïdes intestinales humaines (HIO) micro avec 2 mg/mL FITC-dextran (4 kDa) photographié pendant 20 heures. HIOs étaient également micro avec PBS (contrôle) ou de la toxine de Clostridium difficile TcdA (12,8 ng/µL) ou traités avec 2 mM EGTA ajoute le support de culture externe. Grossissement de X 4. (B) parcelle de moyenne intensité normalisée de FITC au fil du temps à HIOs traités avec PBS (contrôle), TcdA ou EGTA. Barres d’erreur représentent S.E.M. et n = 11 HIOs (contrôle), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole établit une méthode polyvalente pour la microinjection de HIOs dérivés hPSC et dérivé de tissu intestinal organoïdes et la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale en temps réel. Nous avons aussi démontré notre approche à l’analyse et l’interprétation des données obtenues à l’aide de ces méthodes. Compte tenu de l’adoption croissante d’organoïdes intestinale systèmes modèles16,20,21,28 et l’intérêt de longue date dans la perméabilité de la barrière intestinale comme un physiologiquement pertinents fonctionnelle résultat3,4,5,6, nous prévoyons que d’autres personnes travaillant dans ce domaine sera en mesure d’appliquer et de tirer parti de ces méthodes.

Il y a plusieurs étapes qui sont indispensables pour l’application de cette technique. Accès à hPSC de haute qualité – ou tissu dérivée HIO tissu devrait être établi avant une vaste expérimentation avec microinjection. HIO macrostructure peut être hétérogène, avec des variations en taille et en forme, bien que l’identité de tissu et de la morphologie cellulaire est hautement reproductible lors de l’utilisation d’une méthodologie éprouvée pour générer HIOs24. HIOs sphériques consistant en une simple lumière semi transparente et mesure environ 1 mm de diamètre sont idéales pour la microinjection et mesure de la fluorescence luminale en temps réel. Dans certains cas, microinjection échoue, entraînant l’effondrement de la HIO ou fuite évidente de substance injectée. HIOs défaillants peuvent être retirés de la culture bien à la discrétion de l’utilisateur à l’aide d’une micropipette standard. Envisagez les lentilles de l’objectif disponibles sur une plate-forme d’imagerie lors de la sélection HIOs pour microinjection et l’imagerie. En général, 2-4 X objectif objectifs sont idéales pour capter le signal fluorescent HIO complet, même si un objectif 10 X peut être utilisé si les lentilles de faible puissance ne sont pas disponibles ou si les HIOs disponibles sont < 1 mm de diamètre. Logiciel d’imagerie doit permettre la capture automatique d’images fluorescentes à des moments définis dans le temps.

Plusieurs modifications du présent protocole sont possibles afin de répondre aux besoins expérimentaux. Par exemple, les résultats des tests de la fonction barrière pourraient dépendre de la taille moléculaire des composés à l’usage43 et il peut être approprié tester la préparation de dextran de différents poids moléculaires. En outre, l’imagerie fond clair peut être effectuée en plus de l’imagerie de fluorescence comme indicateur de l’intégrité structurale globale du tissu25. Lorsque vous effectuez la microinjection de bactéries vivantes25,28,31,32,33,44, il peut être nécessaire d’ajouter de la pénicilline et streptomycine ou gentamicine pour les milieux de culture HIO avant ou après la microinjection. L’extérieur de la microcapillaire va être contaminée au cours du remplissage avec la suspension de la culture bactérienne et cela peut être transféré dans les médias HIO. Alternativement, microinjection peut être effectuée sur HIOs suspendus dans la matrice extracellulaire (p. ex., Matrigel) sans les médias, ajoutant les médias après que la microinjection est terminée. Cela peut limiter la contamination à la matrice extracellulaire et la face externe de la HIO. Lors de la planification des essais de croissance microbienne, il peut être nécessaire d’enlever des antibiotiques dans les médias après 1-2 h pour éviter de ralentir ou d’empêcher le développement d’organismes microinjectés.

Enfin, reconnaissant que pas tous les chercheurs auront accès à l’équipement de microscopie adapté à l’imagerie de in vitro , il est important de souligner que les procédures décrites dans le présent protocole de collecte de données de fluorescence peuvent être appliquées aux images prises à intervalles fixes microscopie épifluorescente standard sans capture d’image automatisé ou contrôles environnementaux. Exemples de cette approche se trouvent dans les rapports de Leslie et Huang et al. 25, qui ont examiné l’activité toxine Clostridium organoïdes intestinale dérivée de hPSC, et Koenig et Odile et al. 44, qui ont examiné la perméabilité de la barrière épithéliale dans semblables dérivés hPSC organoïdes intestinale micro avec direct e. coli. Le fonctionnement manuel de matériel d’imagerie peut entraîner une plus grande variation et la difficulté en normalisant le signal fluorescent. Exécution manuelle d’imagerie du FITC-dextran injection HIOs, il est essentiel de maintenir le grossissement fixe, intensité d’excitation fluorescente et temps d’exposition tout au long de l’expérience pour ne pas fausser les mesures d’intensité de fluorescence.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiens à remercier les Drs Stephanie Spohn et Abuaita de Bâle pour beaucoup des discussions fructueuses sur organoïde microinjection. JRS est pris en charge par le Consortium de cellules souches intestinales (U01DK103141), un projet de recherche financé par le National Institute of Diabetes et digestif et Kidney Diseases (NIDDK) et le National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). JRS et VBY sont pris en charge par le roman de NIAID, Alternative Model Systems Consortium maladies entériques (NAMSED) (U19AI116482). DRH est pris en charge la subvention des mécanismes de la pathogénie microbienne de formation de la National Institute of Allergy et maladies infectieuses (NIAID, T32AI007528) et le prix de la clinique et translationnelle Science à l’Institut de Michigan de cliniques et de santé Recherche (UL1TR000433).

Les fichiers de données complet et le code d’analyse de données utilisées dans ce manuscrit sont disponibles à https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

Materials

EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
1X PBS Life Technologies 10010-023
Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Manipulator Narshge UM-3C
Micromanipulator Narshge UM-1PF
Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
Magnetic stand Narshge GJ-1
Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
Micropipette puller Sutter Instruments P-30
Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
Glass filaments WPI TW100F-4
Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450
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Referências

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Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).
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