قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي
Summary
هذا البروتوكول وصف قياس نفاذية الحاجز الظهارية في معالجة دوائية التالية في الوقت الحقيقي في أورجانويدس المعوية البشرية باستخدام مجهر فلوري ويعيش خلية مجهرية.
Abstract
وأسفرت أوجه التقدم في الثقافة 3D من الأنسجة المعوية التي تم الحصول عليها عن طريق خزعة أو المتولدة من الخلايا الجذعية pluripotent عن طريق توجيه التمايز، نماذج متطورة في المختبر مخاطية الأمعاء. الاستفادة من هذه النظم النموذجية الجديدة سوف تتطلب تكييف الأدوات والتقنيات المتقدمة لنظم الاستزراع 2D والحيوانات. وهنا يصف لنا تقنية لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي. يتم ذلك عن طريق microinjection ديكستران المسمى فلوريسسينتلي وتصوير المعني مجهر مقلوب مزودة بمرشحات ابيفلوريسسينت. القياس في الوقت الحقيقي من نفاذية الحاجز في الأمعاء أورجانويدس تيسر توليد البيانات العالية الاستبانة الزمانية في الأنسجة الظهارية المعوية البشرية، على الرغم من أن هذا الأسلوب يمكن أن تطبق أيضا على تيميبوينت الثابتة التصوير النهج. هذا البروتوكول سهولة التكيف لقياس نفاذية الحاجز الظهارية عقب التعرض لعوامل دوائية أو المنتجات البكتيرية أو السموم أو الكائنات الحية الدقيقة. مع تعديلات طفيفة، هذا البروتوكول يمكن أيضا بمثابة تمهيدي عام في microinjection أورجانويدس المعوية، ويمكن للمستخدمين اختيار لتكملة هذا البروتوكول مع التطبيقات المتلقين للمعلومات الإضافية أو البديلة عقب microinjection.
Introduction
ظهارة الأمعاء يشكل حاجزاً انتقائي الذي يتوسط اتجاهي نقل المواد المغذية،2س ح والايونات ومنتجات النفايات مع التقليل من تبادل نشر بوساطة غير محدد من الجزيئات الأخرى بين التجويف الوسيطة أنسجة أو دم العرض1،2. نفاذية الحاجز الظهارية المعوية غير محدد منذ فترة طويلة تعتبر معلمة فنية أساسية في الصحة والمرض3،4،،من56، يعكس معدل نشر الجزيئات الصغيرة عبر الظهارة عبر الفضاء باراسيلولار. يمكن إجراء قياس نفاذية الحاجز الظهارية في النماذج الحيوانية7 و المرضى البشرية8 عن طريق ابتلاع lactulose، الذي لديه لا الناقل محددة في الجهاز الهضمي، وجمع اللاحقة وقياس تركيزات lactulose في الدم المحيطي. علامات بلعها بديل لوظيفة الحاجز مثل الكربوهيدرات المسمى فلوريسسينتلي هي أيضا متاح9،10. وهذا النهج قد تم تكييفه للثقافات الخلية الظهارية المعوية نمت على ترانسويل يدعم11، نهج مبسط يسمح لقدر أكبر من السيطرة تجريبية لكنها انتقدت أيضا منبئ فقيرة من فيفو نفاذية نظراً لعدم وجود الأنواع الفرعية الظهارية متمايزة والأنسجة هيكل12. استخدام الدوائر تمثل نهجاً آخر، وتسمح لقياس وظيفة الحاجز الظهارية في الغشاء المخاطي المعوي كله السابقين فيفو13. وكثيراً ما يقتصر تطبيق هذه التقنية الأنسجة توافر والشرط13،14. وهكذا الأساليب الجديدة التي توازن بين إمكانية تكرار نتائج والإنتاجية ذات الصلة الفسيولوجية ضرورية.
لقد أدت التطورات الأخيرة في organogenesis في المختبر إلى اعتماد نظم زراعة الأنسجة 3D النموذجي كمنصة متطورة لأتصدى ديناميات الأنسجة المعقدة15،16،17 ،،من1819،20،21،،من2223. على وجه الخصوص، ظهرت البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسك) تستمد البشرية أورجانويدس المعوية (هيوس)19،24 كنظام استنساخه وتجريبيا يستهدف نموذج لدراسة التفاعلات بين المضيف للميكروبات و حاجز الظهارية ديناميات25،26،،من2728. وبالمثل، يمكن أن يستمد من إجراء خزعة بسيطة أورجانويدس المستمدة من الأنسجة البشرية (يعرف أيضا باسم انتيرويدس) ويمكن استخدامها كنظام المرونة لدراسة علم وظائف الأعضاء البشرية والمرض15،،من2930. Microinjection أورجانويدس المعوية البشرية يسمح لتسليم المركبات التجريبية25 أو تعيش الميكروبات25،31،32،33 إلى قمي طلائي سطح التجويف أورجانويد. ليزلي وهوانغ et al. 25 مؤخرا تكييف هذه التقنية لقياس نفاذية الحاجز في هيوس ميكروينجيكتيد مع fluorescein isothiocyanate (فيتك) المسمى ديكستران عقب التعرض للسموم البكتيرية.
ويهدف هذا البروتوكول كدليل لقياس نفاذية الحاجز الظهارية في هيوس المستمدة من هبسك وهيوس المستمدة من الأنسجة باستخدام مجهر فلوري. مع تعديلات طفيفة، فإنه يمكن أيضا بمثابة تمهيدي عام على microinjection هيوس مع المركبات التجريبية. المستخدمين قد يكمل هذا البروتوكول مع تطبيقات المتلقين للمعلومات الإضافية أو البديلة بعد microinjection.
Protocol
Representative Results
Discussion
يضع هذا البروتوكول طريقة عامة microinjection هيوس المستمدة من هبسك والمستمدة من الأنسجة المعوية أورجانويدس وقياس النفاذية الحاجز الظهارية في الوقت الحقيقي. كما أثبتنا نهجنا لتحليل وتفسير البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الأساليب. ونظرا لتزايد اعتماد أورجانويدس المعوية نظم نموذجية16،،من2021،28 واهتمام منذ أمد بعيد في نفاذية الجدار المعوي كالناحية الفسيولوجية ذات الصلة الوظيفية نتائج3،،من45،6، ونحن نتوقع أن الآخرين الذين يعملون في هذا المجال سوف تكون قادرة على تطبيق والاستفادة من هذه الأساليب.
وهناك العديد من الخطوات التي حاسمة بالنسبة لتطبيق هذا الأسلوب. الحصول على جودة عالية هبسك-أو الأنسجة المشتقة HIO الأنسجة ينبغي قبل إجراء تجارب واسعة النطاق مع microinjection. قد يكون حداتها HIO ايربان، مع اختلاف في الحجم والشكل، وعلى الرغم من أن هوية الأنسجة ومورفولوجيا الخلوية يتم استنساخه بدرجة عالية عند استخدام المنهجية المتبعة لتوليد هيوس24. هيوس كروية تتكون من التجويف شبه شفافة مفردة وقياس حوالي 1 ملم في القطر مثالية ل microinjection وقياس fluorescence لومينال في الوقت الحقيقي. وفي بعض الحالات، سوف تفشل microinjection، مما أدى إلى انهيار HIO أو التسرب الواضح لحقن المواد. يمكن إزالة هيوس الفاشلة من ثقافة جيدا في السلطة التقديرية للمستخدم باستخدام ميكروبيبيتي قياسية. النظر العدسات الهدف المتوفرة على منصة تصوير عند اختيار هيوس microinjection والتصوير. وبصفة عامة، 2-4 X الهدف العدسات مثالية لالتقاط الإشارات الفلورسنت HIO كاملة، على الرغم من أن يمكن استخدام هدفا X 10 إذا لم تتوفر العدسات طاقة منخفضة، أو إذا كانت هيوس المتاحة < 1 ملم في القطر. يجب أن تسمح برامج التصوير لالتقاط الآلي للصور الفلورية في نقاط محددة مع مرور الوقت.
عدة تعديلات لهذا البروتوكول الممكنة كي يتلاءم مع متطلبات التجريبية. على سبيل المثال، قد تكون نتائج اختبارات وظيفة الحاجز تعتمد على حجم الجزيئي للمركبات في استخدام43 وقد يكون من المناسب لاختبار الاستعدادات ديكستران الوزن الجزيئي متفاوتة. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم تنفيذ التصوير برايتفيلد بالإضافة إلى تصوير الأسفار كمؤشر السلامة الهيكلية العامة ل الأنسجة25. عند أداء microinjection من البكتيريا يعيش25،28،31،32،،من3344، قد يكون من الضروري إضافة البنسلين و ستربتوميسين أو الجنتاميسين لوسائل الإعلام ثقافة HIO قبل أو بعد microinjection. الخارجي ميكروكابيلاري سوف تصبح ملوثة أثناء الملء مع تعليق ثقافة البكتيرية، وهذا يمكن نقلها إلى وسائط الإعلام HIO. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء microinjection في هيوس معلقة في المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال، ماتريجيل) بدون وسائل الإعلام، إضافة وسائل الإعلام بعد اكتمال microinjection. وهذا قد يحد من التلوث إلى المصفوفة خارج الخلية والوجه الخارجي HIO. عند التخطيط لفحوصات النمو الميكروبية، فإنه قد يكون من الضروري على إزالة المضادات الحيوية في وسائل الإعلام بعد 1-2 ساعة لتجنب إبطاء أو منع نمو الكائنات ميكروينجيكتيد.
أخيرا، وإذ تسلم بأن ليس جميع الباحثين سوف يحصلون على معدات الفحص المجهري مناسبة للتصوير في المختبر ، من المهم الإشارة إلى أن الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول لجمع البيانات الأسفار يمكن تطبيقها على الصور الملتقطة في تيميبوينتس الثابتة باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينت القياسية دون التقاط الصور الآلي أو الضوابط البيئية. يمكن الاطلاع على أمثلة لهذا النهج في التقارير قبل ليزلي وهوانغ et al. 25، الذين فحصوا نشاط السمية جيم في اشتقاق هبسك أورجانويدس المعوية، وكارفي ومنظمة et al. 44، الذي فحص نفاذية الحاجز الظهارية في مماثلة أورجانويدس المعوية المستمدة من هبسك ميكروينجيكتيد مع العيش كولاي. دليل تشغيل معدات التصوير قد يؤدي مزيد من التباين وصعوبة في تطبيع إشارة الفلورسنت. عند القيام بالتصوير اليدوي من فيتك-ديكستران حقن هيوس من الضروري الإبقاء على التكبير الثابتة، وشدة الإثارة الفلورسنت، وأوقات التعرض طوال هذه التجربة لتجنب تشويه قياسات شدة الفلورسنت.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر الدكتور ستيفاني سبوهن وأبوايتا بازل للعديد من المناقشات المفيدة بشأن microinjection أورجانويد. العمال معتمد من قبل “اتحاد الخلايا الجذعية المعوية” (U01DK103141)، مشروع بحثي تعاوني يمولها المعهد الوطني للسكري والجهاز الهضمي، وأمراض الكلي (NIDDK) والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (نييد). العمال وفبي معتمدة من “رواية نييد”، نظم نموذج بديل لاتحاد الأمراض المعوية (نامسيد) (U19AI116482). DRH ويدعم “الآليات المرضية الجرثومية” منحة التدريب من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (نييد، T32AI007528) وجائزة السريرية والعلوم متعدية الجنسيات إلى معهد ميشيغان السريرية والصحة البحوث (UL1TR000433).
تتوفر ملفات بيانات كاملة وبيانات تحليل التعليمات البرمجية المستخدمة في هذه المخطوطة في https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.
Materials
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
| Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
| Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
| 1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Manipulator | Narshge | UM-3C | |
| Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
| Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
| Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
| Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
| Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
| Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
| Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
| Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
| 1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
| 1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |
Referências
- Standring, S., Borley, N. . Gray’s anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
- Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
- Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
- Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
- Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
- Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
- Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
- Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
- Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
- Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
- Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
- Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
- McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
- Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
- Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
- Bancroft, J., Gamble, M. . Theory and practice of histological techniques. , (2008).
- Kennedy, S., Oswald, N. . PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).
- Kurien, B., Scofield, R. . Western blotting: Methods and protocols. , (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Winston, W. . Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
- Rosenbaum, S. . Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).
- Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
- Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
- Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).
