Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.
Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.
Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota que especificamente necessária para a produção do grande subunidade ribossomal6, e é conhecido como WD-repetição contendo 74 (WDR74) no maior organismos7. WDR74 tem demonstrado ser necessário para a formação de blastocistos em ratos8e o promotor de WDR74 é frequentemente uma mutação em células de câncer9. No entanto, a função e mecanismos precisos de Nsa1/WDR74 no assembly do Ribossoma ainda são em grande parte desconhecidos. Para começar a descobrir o papel de Nsa1/WDR74 durante o amadurecimento do Ribossoma eucariota, realizaram-se várias análises estruturais, incluindo cristalografia de raios x e pequeno ângulo de espalhamento (SAXS) de raio-x10.
Cristalografia de raios x, espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), microscopia eletrônica e SAXS são todos importantes técnicas para estudar a estrutura macromolecular. Tamanho, forma, disponibilidade e estabilidade das influências de macromoléculas, o método de biologia estrutural, para o qual uma macromolécula particular será melhor adequado, no entanto, combinar várias técnicas através de uma abordagem so-called “híbrido” está se tornando um ferramenta cada vez mais benéfico11. Em particular, cristalografia de raios x e SAXS são complementares e poderosos métodos para determinação estrutural de macromoléculas12.
Cristalografia fornece estruturas atômicas de alta resolução, variando de pequenas moléculas a grande maquinaria celular, tais como o ribossoma e levou a inúmeros avanços na compreensão das funções biológicas das proteínas e outros macromoléculas13. Além disso, o design de drogas baseado em estrutura aproveita o poder da estruturas de cristal para encaixe molecular por métodos computacionais, acrescentando uma dimensão crítica a droga descoberta e desenvolvimento de14. Apesar de sua ampla aplicabilidade, sistemas flexíveis e desordenados são difíceis de avaliar por cristalografia, desde que a embalagem de cristal pode ser prejudicada ou mapas de densidade de elétrons podem ser incompletos ou de má qualidade. Por outro lado, SAXS é uma abordagem estrutural baseada em solução e baixa resolução capaz de descrever sistemas flexíveis, variando de loops desordenados e termini a proteínas intrinsecamente desordenado12,15,16. Considerando que é compatível com uma ampla gama de tamanhos de partículas12, SAXS pode trabalhar em sinergia com cristalografia para ampliar o leque de questões biológicas que podem ser abordados pelos estudos estruturais.
Nsa1 é apropriado para uma abordagem estrutural de híbrido, porque ele contém um domínio WD40 bem estruturado, seguido de um C-terminal funcional, mas flexível que não é passível de métodos de cristalografia de raios x. A seguir é um protocolo para a clonagem, expressão e purificação de S. cerevisiae Nsa1 para determinação estrutural híbrido por cristalografia de raios x e SAXS. Este protocolo pode ser adaptado para estudar as estruturas de outras proteínas que são compostas por uma combinação de regiões ordenadas e desordenadas.
Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Ns…
The authors have nothing to disclose.
Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa programa nacional; E.U. Instituto Nacional de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) (ZIA ES103247 de R. E. S.) e os institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR, 146626 para M.C.P). Uso de APS foi apoiado pelo departamento de energia, escritório de ciência, escritório de energia ciências básicas sob contrato n º W-31-109-Eng-38. Uso da fonte de luz avançado (ALS) foi apoiado pelo Director, Office of Science, escritório de energia ciências básicas, o departamento de energia dos EUA, sob contrato n º DE-AC02-05CH11231. Suporte adicional para a trajetória de SIBILAS SAXS vem do Instituto Nacional de saúde do projeto MINOS (R01GM105404) e um high-end instrumentação Grant S10OD018483. Também gostaríamos de agradecer a Andrea Moon e Dr. Sara Andres por sua leitura crítica deste manuscrito.
Molecular Cloning of Nsa1 | |||
pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
Primers for cloning Nsa1 | |||
SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
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SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
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SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
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SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
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Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
Crystallization, Proteolytic Screening | |||
Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
Equipment | |||
UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
Software/Websites | |||
HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
Phenix | Adams et al., 2010 | ||
Coot | Emsley et al., 2010 | ||
ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
EOM | Tria et al, 2015 |